陳遠興，申茜，王驥，楊靜文，莊朋偉，郭虹

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；2.甘肅中天金丹藥業(yè)有限公司，甘肅 748100）

免疫力作為身體防御最基本的機制具有重要意義，其作用主要體現(xiàn)在維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，抵抗細菌、病毒或病原體入侵等[1]。免疫功能低下，機體識別和排除“異己”的能力不足，身體呈現(xiàn)不抵抗?fàn)顟B(tài)。近年來天然藥物對于各種疾病的治療起到了關(guān)鍵作用，尤其在增強機體免疫力方面效果顯著[2]。

紅芪作為甘肅的道地中藥材，來源于豆科植物多序巖黃芪Hedysarumpolybotrys Hand.-Mazz.的干燥根。文獻報道，紅芪具有抗腫瘤、抗纖維化和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等作用[3-5]。紅芪在免疫調(diào)節(jié)方面的臨床療效較黃芪更具有優(yōu)勢，其補中益氣藥效作用可能強于黃芪[6]。紅芪口服液主要由紅芪提取物精制而成，臨床用于氣虛所致的身體乏力，心悸失眠，食少便溏，面色無華，研究者對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行了系統(tǒng)研究[7]，但目前關(guān)于其藥理作用尤其增強免疫作用的系統(tǒng)研究尚無報道。因此，本研究通過考察紅芪口服液對免疫低下小鼠免疫器官臟器指數(shù)、外周血細胞計數(shù)、淋巴細胞功能以及單核-巨噬細胞吞噬能力等指標(biāo)的影響，評價紅芪口服液提高免疫力的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性昆明小鼠（20±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。小鼠飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)動物房，室內(nèi)溫度（22±2）℃，相對濕度45%～75%。

1.1.2 藥物與試劑 紅芪口服液（批號200502）由甘肅中天金丹藥業(yè)有限公司提供；環(huán)磷酰胺（批號20100202）購自山西普德藥業(yè)有限公司；刀豆蛋白（Con A，C8110）、脂多糖（LPS，L8880）、紅細胞裂解液（R1010）、小鼠外周血淋巴細胞分離液（P8620）、4%綿羊紅細胞（S9450）、雞紅細胞（批號 S7300）均購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8試劑盒（CK04）購自日本同仁化學(xué)研究所。

1.1.3 主要儀器 B5185全自動血液分析儀（美國，愛德士），spark多功能酶標(biāo)儀（奧地利，帝肯），DM750顯微鏡（德國，徠卡）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組、造模和給藥 將小鼠隨機分為正常組、模型組、紅芪口服液低（紅芪低）、中（紅芪中）、高（紅芪高）劑量組。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，除正常組外，其余各組小鼠連續(xù)7 d腹腔注射環(huán)磷酰胺（35 mg/kg），建立免疫低下小鼠模型。模型建立同時，紅芪口服液低、中、高劑量組分別灌胃給予5．2 mL/kg（臨床等效劑量）、20．8 mL/kg（臨床4倍等效劑量）、41．6 mL/kg（臨床8倍等效劑量）的紅芪口服液，正常組和模型組給予等量蒸餾水。各組小鼠于末次灌胃給藥24 h后，檢測各項指標(biāo)。

1.2.2 小鼠脾臟和胸腺指數(shù) 末次給藥24 h后，各組小鼠進行稱質(zhì)量，頸椎脫臼處死，分離脾臟、胸腺，精密稱量并記錄，計算小鼠脾臟和胸腺指數(shù)。脾臟指數(shù)為脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量（mg/g），胸腺指數(shù)為胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量（mg/g）。

1.2.3 小鼠外周血的測定 各組小鼠摘眼球取血，取適量全血用枸櫞酸鈉進行抗凝處理，全自動血液分析儀對外周血中血細胞計數(shù)。

1.2.4 小鼠脾淋巴細胞懸液制備 實驗結(jié)束后，頸椎脫臼處死小鼠，于75%乙醇中浸泡5 min，無菌條件下分離各組小鼠脾臟置于一次性平皿中，小心剔除脂肪和結(jié)締組織，并用RPMI 1 640培養(yǎng)液進行沖洗。沖洗后使用一次性注射器對小鼠脾臟進行反復(fù)吹打直至脾臟外膜變得透明，使細胞分離出來。將分離的細胞轉(zhuǎn)入離心管中，轉(zhuǎn)速2 500 rpm，離心半徑8 cm，離心5 min棄上清，收集下層脾細胞。紅細胞裂解液對紅細胞進行破除，破除2次后再次離心收集細胞。加入含10%胎牛血清的RPMI 1 640完全培養(yǎng)液重懸，0．4%臺盼藍染液染色，細胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細胞數(shù)為5×106/mL個，備用。

1.2.5 脾淋巴細胞增殖實驗 將已制備好的脾淋巴細胞懸液加入到96孔板中，每孔100 μL，同時每孔加入100 μL終濃度為5 μg/mL的Con A或終濃度為20 μg/mL的LPS。將96孔板置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h，加入10%CCK-8溶液，孵育30min，酶標(biāo)儀在450nm波長處測量OD值。

細胞增殖率（%）=各實驗組OD值/正常組OD值×100%

1.2.6 玫瑰花結(jié)實驗 取小鼠抗凝血與等量生理鹽水混勻，緩慢加入到裝有淋巴分離液的離心管中，2 500 rpm離心20 min，離心半徑8 cm，小心吸出淋巴細胞層，加入平衡鹽溶液洗滌兩次，棄上清，加入0．4 mL的10%新生牛血清培養(yǎng)液制備成細胞懸液。加入等量的4%綿羊紅細胞混勻，37℃孵育5 min后，1 000 rpm離心5 min，離心半徑8 cm。4℃下放置2 h，涂片，染色后油鏡（×100）觀察玫瑰花結(jié)陽性數(shù)，計數(shù)200個淋巴細胞，以結(jié)合3個以上綿羊紅細胞的淋巴細胞為玫瑰花結(jié)形成細胞，同時計算得出百分率。

1.2.7 碳廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)的測定 實驗結(jié)束后，各組小鼠按照0．05 mL/10 g劑量，尾靜脈注射經(jīng)生理鹽水4倍稀釋的印度墨汁，分別在注射后2 min（記為時間點1）和10 min（記為時間點2）眼眶采血 20 μL，并加入 0．1%碳酸鈉溶液 2 mL處理，酶標(biāo)儀測定600 nm處吸光度值。取血完畢后立即頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱質(zhì)量并記錄。計算廓清指數(shù)（K）和吞噬指數(shù)（α）。

1.2.8 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬實驗 實驗結(jié)束后，各組小鼠腹腔注射雞紅細胞懸液0．5 mL，并于注射后1～2 h，頸椎脫臼處死，剪開腹部皮膚，注入2 mL生理鹽水，輕揉小鼠腹部，吸取腹腔液1 mL，平均分滴在兩個載玻片上，37℃孵育30 min，孵育后于生理鹽水中漂洗，以除去未貼片細胞。以1∶1丙酮甲醇溶液固定3 min，Giemsa染液染色8 min，洗片，油鏡觀察，計算吞噬率和吞噬指數(shù)。

吞噬率（%）=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)/計數(shù)的巨噬細胞數(shù)×100%

吞噬指數(shù)＝被吞噬的雞紅細胞數(shù)/計數(shù)的巨噬細胞數(shù)

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 23．0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件處理各組數(shù)據(jù)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LDS法，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅芪口服液對免疫低下小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響 脾臟和胸腺是機體的主要免疫器官，其質(zhì)量的改變可以反映受試藥物對免疫系統(tǒng)的刺激作用。因此，脾臟和胸腺指數(shù)被認(rèn)為是測試免疫功能的重要指標(biāo)。如圖1所示，與正常組比較，模型組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著下降，說明成功復(fù)制了小鼠免疫低下模型。與模型組比較，紅芪低、紅芪中、紅芪高劑量組均能不同程度增加模型小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。表明紅芪口服液能夠有效改善免疫低下小鼠脾臟和胸腺損傷，促進免疫器官的發(fā)育，增強機體免疫能力。

圖1 紅芪口服液對免疫低下小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響Fig.1 Effects of Hongqi oral liquid on spleen and thymus indices in immunocompromised mice

2.2 紅芪口服液對免疫低下小鼠外周血細胞的影響 如圖2所示，與正常組比較，模型組小鼠全血白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞數(shù)以及血紅蛋白濃度均顯著減少，同時單核細胞數(shù)明顯增加，表明環(huán)磷酰胺導(dǎo)致免疫低下小鼠血細胞異常變化。與模型組比較，紅芪低、紅芪中、紅芪高劑量組均能不同程度升高小鼠白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、單核細胞數(shù)量，增加血紅蛋白濃度，其中以高劑量組效果最為顯著。

圖2 紅芪口服液對免疫低下小鼠外周血細胞的影響Fig.2 The effect of Hongqi oral liquid on peripheral blood cells of immunocompromised mice

2.3 紅芪口服液對免疫低下小鼠脾淋巴細胞增殖率的影響 ConA和LPS可以分別誘導(dǎo)T、B淋巴細胞的增殖活化。本實驗中，筆者以ConA和LPS誘導(dǎo)刺激體外分離的脾淋巴細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組T、B淋巴細胞增殖率均明顯降低；而小鼠灌胃紅芪口服液后，體外脾淋巴細胞增殖率均有不同程度的促進作用，其中紅芪中、高劑量組可以同時顯著提升T、B淋巴細胞增殖率，明顯提高機體免疫能力。結(jié)果見圖3。

2.4 紅芪口服液對免疫低下小鼠淋巴細胞玫瑰花結(jié)形成的影響 結(jié)果如圖4所示，與正常組比較，模型組玫瑰花結(jié)百分率明顯減少；而小鼠灌胃紅芪口服液后，與模型組比較，紅芪中、紅芪高劑量組均能明顯增加玫瑰花結(jié)百分率；結(jié)果表明紅芪口服液可非特異性地增強細胞免疫，進而提高機體免疫功能。

圖4 紅芪口服液對免疫低下小鼠淋巴細胞玫瑰花結(jié)形成的影響Fig.4 The effect of Hongqi oral liquid on lymphocyte rosette formation in immunocompromised mice

2.5 紅芪口服液對免疫低下小鼠巨噬細胞碳廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)的影響 巨噬細胞碳廓清實驗是觀察機體非特異性免疫功能的經(jīng)典方法，廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)愈大，吞噬功能愈強；反之則弱。因此本研究通過測定小鼠巨噬細胞碳廓清指數(shù)K和吞噬系數(shù)α來觀察單核-巨噬細胞系統(tǒng)的吞噬廓清能力強弱。研究結(jié)果表明，與正常組比較，模型組的碳廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)均無明顯變化；但小鼠灌胃紅芪口服液后，碳廓清指數(shù)K值和吞噬指數(shù)α值均有所升高，其中以紅芪高劑量組效果最為顯著；表明紅芪口服液能促進機體單核-巨噬細胞的吞噬作用，增強非特異性免疫功能。結(jié)果見圖5。

圖5 紅芪口服液對免疫低下小鼠巨噬細胞碳廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)的影響Fig.5 Effects of Hongqi oral liquid on the carbon clearance index and phagocytosis index of macrophages in immunocompromised mice

2.6 紅芪口服液對免疫低下小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響 雞紅細胞對于小鼠是一種較強的抗原，當(dāng)與巨噬細胞混合孵育一定時間后，雞紅細胞會被吞噬，涂片染色鏡檢，根據(jù)吞噬率和吞噬指數(shù)可以反映小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力。如圖6所示，與正常組比較，模型組巨噬細胞吞噬率和吞噬指數(shù)均顯著性降低，說明巨噬細胞的吞噬活性被抑制。小鼠給予紅芪口服液后，紅芪高劑量組能顯著升高巨噬細胞吞噬率和吞噬指數(shù)，與模型組比較差異顯著；紅芪中劑量組有升高吞噬率和吞噬指數(shù)的趨勢。結(jié)果提示，紅芪口服液能增強免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力，發(fā)揮增強免疫的作用。

圖6 紅芪口服液對免疫低下小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率和吞噬指數(shù)的影響Fig.6 Effects of Hongqi oral liquid on phagocytic rate and phagocytic index of peritoneal macrophages in immunocompromised mice

3 討論

環(huán)磷酰胺常被用于構(gòu)建免疫抑制動物模型[8]。本實驗采用連續(xù)多次注射環(huán)磷酰胺（35 mg/kg）的方法建立小鼠免疫抑制模型。小鼠注射環(huán)磷酰胺后，可見毛發(fā)脫落，體質(zhì)量明顯下降，脾臟萎縮，以及外周血中白細胞計數(shù)減少等，說明環(huán)磷酰胺成功造成小鼠免疫系統(tǒng)的損傷。紅芪口服液是中藥紅芪的提取物，研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用紅芪口服液治療后，模型小鼠的脾臟和胸腺指數(shù)顯著提升，外周血中白細胞計數(shù)、血紅蛋白水平等明顯升高，表明紅芪口服液具有調(diào)節(jié)機體免疫功能的作用。

淋巴細胞增殖和玫瑰花結(jié)形成實驗一直作為免疫性疾病不可缺少的依據(jù)。本實驗結(jié)果顯示，紅芪口服液能顯著促進ConA誘導(dǎo)的脾T淋巴細胞及LPS誘導(dǎo)的B淋巴細胞增殖，且可以明顯增加淋巴細胞玫瑰花結(jié)的形成，提高細胞免疫應(yīng)答。

碳廓清實驗和雞紅細胞吞噬實驗，常用以評價巨噬細胞的吞噬清除功能[9-10]。在碳廓清實驗中，小鼠尾靜脈注射墨汁后，模型組的碳廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)與正常組比較無明顯差異，推測這可能與外周血中單核細胞計數(shù)未見明顯變化有關(guān)。小鼠灌胃紅芪口服液治療后，碳廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)均有所升高，其中以高劑量組效果最為明顯。同樣，小鼠腹腔巨噬細胞吞噬實驗結(jié)果也表明，紅芪口服液高劑量組小鼠的吞噬百分率和吞噬指數(shù)均顯著升高。提示，紅芪口服液可以通過增加巨噬細胞吞噬清除活性，從而提高機體免疫力。

綜上所述，紅芪口服液對由環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠具有較好的免疫保護作用，其在細胞免疫、體液免疫、單核-巨噬細胞功能等方面均表現(xiàn)出正向調(diào)節(jié)作用。紅芪口服液在增強免疫力方面具有很好的研究價值與應(yīng)用前景，在明確其藥理作用的基礎(chǔ)上，其調(diào)節(jié)機體免疫功能的具體分子機制是今后進一步深入研究的重點方向。