李新通，毛世剛，范寶珠，劉洋，潘瑋敏，黃曉宇，劉凱

(1.青島市市立醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，山東 青島 266071； 2.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000；3.西安體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)與健康科學(xué)學(xué)院，西安 710068)

關(guān)節(jié)軟骨是高度分化的結(jié)締組織，可使關(guān)節(jié)具有較好的彈性以及幾乎無摩擦的運(yùn)動(dòng)[1]。膝關(guān)節(jié)的軟骨損傷較常見，60%～66%接受膝關(guān)節(jié)鏡檢查的患者會(huì)出現(xiàn)軟骨損傷[2]。由于軟骨無直接的血液、淋巴供應(yīng)或神經(jīng)支配，再生潛力有限，若不及時(shí)治療可能發(fā)生進(jìn)行性軟骨變性，最終引起骨關(guān)節(jié)炎[3]。目前，臨床常用的軟骨損傷修復(fù)方法主要包括微骨折技術(shù)、軟骨下骨鉆孔和自體軟骨細(xì)胞植入等，但可獲得性有限且具有供體部位并發(fā)癥，限制了其進(jìn)一步臨床應(yīng)用[4]。近年來，隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，間充質(zhì)干細(xì)胞在修復(fù)軟骨損傷方面已取得一定進(jìn)展，且具有獲得和培養(yǎng)相對(duì)容易、免疫原性弱、成軟骨分化能力等特點(diǎn)，同時(shí)其安全性也得到證實(shí)[5]。脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)具有軟骨分化潛能，且來源豐富、獲取容易、同源性好、生長快速；此外，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，ADSCs供體部位不良反應(yīng)少，因此具有巨大的臨床應(yīng)用潛力[6]。近年來，研究者以ADSCs的成軟骨分化機(jī)制為基礎(chǔ)，從生長環(huán)境、培養(yǎng)條件等方面探索高效的ADSCs成軟骨分化過程，并逐步應(yīng)用于臨床膝關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療?，F(xiàn)就ADSCs的成軟骨分化及其在膝關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 ADSCs的生物學(xué)特性

干細(xì)胞具有貼壁生長、表達(dá)特異性細(xì)胞表面抗原、自我更新和多向分化潛能等特征。Zuk等[7]于2001年首次發(fā)現(xiàn)人體脂肪細(xì)胞提取物具有干細(xì)胞特性，并將其命名為ADSCs。ADSCs來源廣泛、取材方便，目前絕大多數(shù)ADSCs是通過脂肪抽吸術(shù)或脂肪切除術(shù)并經(jīng)膠原酶消化、離心分離獲得。研究表明，ADCSs接種24 h后，細(xì)胞貼壁呈大小不一的圓形、多角形或短梭形狀；進(jìn)入增殖期ADSCs 逐漸伸展，形態(tài)呈現(xiàn)出與成纖維細(xì)胞相似的長梭形[8]。國際脂肪應(yīng)用技術(shù)協(xié)會(huì)指出，新分離的ADSCs 表型為CD31-/CD34+/CD45-/CD235a-，經(jīng)過體外培養(yǎng)的ADSCs表型則為CD31-/CD44+/CD45-/CD73+/CD90+/CD105+[9]。由于ADSCs無明確的特異性表面抗原，未來應(yīng)進(jìn)一步關(guān)注體外ADSCs的高效分離和純化。

ADSCs具有包括成軟骨分化在內(nèi)的多項(xiàng)分化潛能。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均顯示，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，ADSCs的軟骨分化能力較低，但ADSCs增殖更快，能夠較好地維持增殖分化潛能、抗氧化防御系統(tǒng)以及能量代謝等，使其不受所處疾病微環(huán)境的影響，從而更好地耐受缺血、缺氧等關(guān)節(jié)軟骨微環(huán)境引起的凋亡，發(fā)揮抗炎作用，使ADSCs在病理環(huán)境中仍可調(diào)節(jié)微環(huán)境[4，10]。此外，ADSCs還具有不易凋亡、來源廣泛、容易獲得等優(yōu)勢(shì)[6]，且ADSCs的人類白細(xì)胞抗原-ABC表達(dá)相對(duì)較少，因此免疫排斥發(fā)生率更低，更適用于同種異體移植[11]。

但ADSCs的生物學(xué)特性受供者年齡、脂肪采集部位等影響，且隨著年齡的增長，在端?？s短、DNA損傷累積以及氧化應(yīng)激等因素作用下，ADSCs的增殖能力逐漸降低[12]。Tang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，來源于內(nèi)臟的ADSCs具有更好的增殖效果，來源于皮下的ADSCs則在免疫抑制性以及成軟骨潛能等方面具有優(yōu)勢(shì)。另有研究表明，取材于髕下脂肪墊的ADSCs表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗炎和抗衰老能力，與皮下脂肪組織來源的ADSCs相比具有更佳的軟骨缺損修復(fù)潛能[14-16]。因此，未來的研究應(yīng)充分考慮ADSCs生物學(xué)特性的多重影響，從而更好地促進(jìn)ADSCs在軟骨損傷修復(fù)方面發(fā)揮高效的作用。

2 ADSCs成軟骨分化過程及調(diào)控途徑

2.1ADSCs成軟骨分化過程 ADSCs的骨系分化與成脂分化相互聯(lián)系，成脂分化誘導(dǎo)增強(qiáng)可抑制骨系基因，促進(jìn)成脂基因表達(dá)；骨系分化誘導(dǎo)增強(qiáng)，與成脂分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體保留于胞質(zhì)中，成脂基因表達(dá)受到抑制，而與ADSCs分化為骨-軟骨祖細(xì)胞相關(guān)的Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2則從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核，導(dǎo)致骨系基因表達(dá)增強(qiáng)，分化為骨-軟骨祖細(xì)胞[17-18]。骨-軟骨祖細(xì)胞具備成骨分化和成軟骨分化能力，而成軟骨分化受SRY相關(guān)高遷移率族盒蛋白9(SRY-related high mobility group-box 9，Sox-9)與Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2平衡的調(diào)控，其中Sox-9保留軟骨形態(tài)表型，而Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2充當(dāng)成骨分化的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子；經(jīng)誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞方向分化的骨-軟骨祖細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)Sox-9，并促進(jìn)Ⅱ型膠原、Ⅸ型膠原、蛋白聚糖以及軟骨低聚基質(zhì)蛋白等軟骨基質(zhì)蛋白的表達(dá)[16，19]。

2.2ADSCs成軟骨分化調(diào)控途徑 由于ADSCs具有多向分化潛能，將其應(yīng)用于膝關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)時(shí)應(yīng)充分考慮使其向目標(biāo)細(xì)胞類型的高效轉(zhuǎn)化。目前的研究表明，可通過外源性生長因子及特定培養(yǎng)基、低氧環(huán)境、新型生物材料支架等調(diào)節(jié)ADSCs向軟骨細(xì)胞分化[20]。

ADSCs分化為軟骨細(xì)胞的傾向高度依賴于培養(yǎng)條件，將其置于特定的生長因子中更有利于ADSCs的成軟骨分化。據(jù)報(bào)道，ADSCs的成軟骨分化潛能減弱可能是由于缺乏轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β1受體或骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信使RNA表達(dá)降低所致[21]。TGF-β超家族是目前主要的軟骨誘導(dǎo)生長因子。有研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs可通過TGF-β1途徑促進(jìn)糖胺多糖、Sox-9、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α等表達(dá)，抑制破壞軟骨再生的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-3和MMP-13的表達(dá)，同時(shí)調(diào)節(jié)具有抑制軟骨細(xì)胞凋亡作用的胱天蛋白酶3的表達(dá)[22]，表明ADSCs對(duì)促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖及再生均具有積極作用。另有研究利用TGF-β3和BMP-6誘導(dǎo)ADSCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2～4周內(nèi)軟骨細(xì)胞形成并被Ⅱ型膠原蛋白包圍，同時(shí)10個(gè)主要的軟骨形成基因表達(dá)均上調(diào)，經(jīng)組織學(xué)、免疫組織化學(xué)和基因表達(dá)譜證實(shí)，ADSCs在培養(yǎng)物中被轉(zhuǎn)化為透明樣軟骨[23]。此外，TGF-β2、BMP-2、BMP-7、BMP-9以及BMP-14等也可使脂肪干細(xì)胞發(fā)生軟骨分化，但大多需3～4周才能完全分化[19，24]。已有研究證實(shí)，一些生長因子(如成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子1)可通過下調(diào)腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導(dǎo)劑基因的表達(dá)、激活磷酸化促分裂原活化的蛋白激酶等途徑上調(diào)Sox-9的表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)軟骨形成的作用[11，18]。

由不同生長因子參與組成的培養(yǎng)基也被應(yīng)用于體外誘導(dǎo)ADSCs成軟骨分化。常見的方案包括：①杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基和TGF-β3、白蛋白(1.25 μg/ml)、地塞米松(1×107mol/L)、抗壞血酸(6.25 μg/ml)、轉(zhuǎn)鐵蛋白和胰島素(6.25 μg/ml)[25]；②杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基+1%胎牛血清，TGF-β1(10 ng/ml)、抗壞血酸-2-磷酸酯(50 nmol/L)、胰島素(6.25 μg/ml)[7]；③OriCell成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基和TGF-β3、地塞米松、抗壞血酸、ITS細(xì)胞培養(yǎng)添加劑、丙酮酸鈉以及脯氨酸[26]。雖然不同生長因子參與組成的培養(yǎng)基對(duì)體外誘導(dǎo)ADSCs成軟骨分化的影響目前仍不明確，但良好的生物因子及化學(xué)因子環(huán)境最終可促進(jìn)ADSCs成軟骨分化。

此外，通過改變物理因子環(huán)境(如創(chuàng)造缺氧條件、離心重力刺激)，ADSCs也可選擇性成軟骨分化。低氧環(huán)境可使缺氧誘導(dǎo)因子穩(wěn)定表達(dá)，從而促進(jìn)ADSCs增殖及成軟骨分化相關(guān)基因表達(dá)，以提高其軟骨分化效率[27]。但不同濃度的氧對(duì)ADSCs成軟骨能力的影響存在差異。培養(yǎng)環(huán)境限制在5%的氧氣條件或可更好地提高ADSCs的軟骨選擇性和生成量，而1%～3%的低氧條件對(duì)ADSCs成軟骨能力無影響[28]。此外，利用離心重力刺激和支架也可促進(jìn)軟骨發(fā)生。由離心力對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物施加壓力等形成的機(jī)械力，可通過對(duì)細(xì)胞外應(yīng)激的反應(yīng)影響ADSCs的成軟骨分化，且有利于降低污染風(fēng)險(xiǎn)、節(jié)約操作時(shí)間[29]。據(jù)報(bào)道，2 400×g條件下，15 min離心重力刺激可顯著提高Sox-9基因和蛋白的表達(dá)水平[30]。

雖然在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)環(huán)境下ADSCs可分化為軟骨，但軟骨細(xì)胞在二維表面的生長容易達(dá)到接觸抑制，長期培養(yǎng)會(huì)產(chǎn)生去分化，導(dǎo)致Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)增加、Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)減少[31]。而常見的三維培養(yǎng)方法主要包括微球培養(yǎng)、微團(tuán)培養(yǎng)以及支架法，但微球培養(yǎng)和微團(tuán)培養(yǎng)存在營養(yǎng)不足等缺陷，因此目前的研究更多地關(guān)注支架材料。大部分三維模型構(gòu)造的關(guān)鍵在于模擬軟骨細(xì)胞所處的天然軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，借助于模型的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性形成接近生理狀態(tài)的軟骨結(jié)構(gòu)[18]。合格的三維支架材料不但具備親水性、細(xì)胞黏性、孔隙率、良好的力學(xué)性能以及可控的降解速率等優(yōu)勢(shì)，還可通過模仿生理環(huán)境或利用趨化劑誘導(dǎo)移行克服體外細(xì)胞間接觸帶來的生長抑制作用，增加細(xì)胞間交流[32]；同時(shí)，輕度缺氧狀態(tài)還可通過激活磷酸化p38促分裂原活化的蛋白激酶、蛋白激酶B及缺氧誘導(dǎo)因子-1α信號(hào)通路上調(diào)Sox-9表達(dá)，具有良好的促軟骨分化能力[33]。近年來，隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，生物可降解乳酸-乙醇酸支架、非網(wǎng)眼聚乙醇支架、Ⅱ型膠原透明質(zhì)酸支架、聚乙二醇聚丙炔共聚物蛋白支架、京尼平交聯(lián)生物支架、3D膠原海綿支架、軟骨脫細(xì)胞支架等不斷出現(xiàn)，對(duì)促進(jìn)ADSCs的軟骨分化及性能的維持具有重要意義[34-35]。但目前的支架材料仍存在強(qiáng)度不足、軟骨分化不全以及去分化等方面的缺陷，相信隨著支架材料的不斷改進(jìn)，可制備出更具有臨床應(yīng)用價(jià)值、理想的軟骨組織工程支架材料。

總之，ADSCs的成軟骨分化是一個(gè)復(fù)雜的過程，高度依賴于生長環(huán)境及培養(yǎng)條件。雖然存在通用方法，但具體哪種條件組合可優(yōu)化ADSCs的產(chǎn)量、提高軟骨分化能力目前尚未達(dá)成共識(shí)，仍需未來進(jìn)一步研究闡明。

3 ADSCs在膝關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)中的應(yīng)用

3.1動(dòng)物研究 ADSCs憑借較好的成軟骨分化能力成為治療軟骨損傷的潛在方法。目前的研究主要集中于由大鼠及兔等動(dòng)物構(gòu)建的膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)模型或軟骨缺損模型的ADSCs治療。Mei等[36]在KOA模型大鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射懸浮于60 μl磷酸鹽緩沖液中的單劑量ADSCs(1.0×106個(gè)細(xì)胞)觀察其療效，并從宏觀和組織學(xué)角度評(píng)估發(fā)現(xiàn)，ADSCs的有益作用在治療后4周出現(xiàn)，ADSCs治療后大鼠的軟骨退化顯著減輕，但并未誘導(dǎo)生成新軟骨，治療后8周，與僅應(yīng)用60 μl磷酸鹽緩沖液的大鼠相比，應(yīng)用ADSCs治療的KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變明顯較弱。表明ADSCs可有效抑制軟骨退變，后續(xù)研究也支持這一觀點(diǎn)[37-38]。Zhou等[37]將ADSCs(2.0×106個(gè)細(xì)胞)注射入KOA模型大鼠的膝關(guān)節(jié)腔(每周2次，共8次)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADSCs可通過誘導(dǎo)自噬減少促炎細(xì)胞因子分泌、抑制軟骨細(xì)胞凋亡，并在調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長因子受體1、盤狀結(jié)構(gòu)域受體2、磷酸化鈣-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ/鈣-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ以及磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮重要作用，減輕大鼠KOA癥狀。另有研究證實(shí)，與單獨(dú)ADSCs或軟骨細(xì)胞治療相比，ADSCs(1.0×107個(gè)細(xì)胞)和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)并單次注射3個(gè)月后，關(guān)節(jié)軟骨再生能力顯著增強(qiáng)[39]。表明ADSCs與其他物質(zhì)共培養(yǎng)可能是提高ADSCs成軟骨分化能力、修復(fù)軟骨缺損的有效途徑。此外，ADSCs在兔模型中也廣泛應(yīng)用。Dragoo等[40]分離新西蘭白兔的自體ADSCs并在體外誘導(dǎo)后種植于纖維蛋白膠支架上培養(yǎng)1周，最后再移植至其軟骨損傷區(qū)，8周后評(píng)估顯示，新西蘭白兔表面軟骨損傷區(qū)被透明樣軟骨填充，軟骨下骨全部被修復(fù)。研究表明，Ⅴ型膠原蛋白可通過增強(qiáng)ADSCs的增殖分化能力顯著上調(diào)軟骨相關(guān)基因Ⅱ型膠原a1和聚蛋白多糖的表達(dá)，下調(diào)Pou5fl(POU domain,class 5,transcription factor 1)的表達(dá)，誘導(dǎo)兔KOA模型軟骨退行性變區(qū)域Ⅱ型膠原蛋白水平顯著增加，并表現(xiàn)出軟骨厚度和軟骨細(xì)胞數(shù)量增加、蛋白聚糖丟失及凋亡軟骨細(xì)胞數(shù)量減少等典型的關(guān)節(jié)軟骨再生跡象[41]。膠原蛋白對(duì)軟骨的黏附和形成至關(guān)重要，而Ⅴ型膠原蛋白是保持軟骨骨架結(jié)構(gòu)完整性的關(guān)鍵成分，未來應(yīng)進(jìn)一步揭示Ⅴ型膠原蛋白在ADSCs軟骨修復(fù)過程中的潛在作用。此外，部分學(xué)者通過構(gòu)建比格犬KOA模型、巴馬小型豬軟骨缺損模型等研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs也可發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成、軟骨細(xì)胞增殖以及抗炎等作用，并表現(xiàn)出積極的膝關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)作用[42-43]。但不同的ADSCs注射劑量和治療方案均可在一定程度上影響療效或研究結(jié)果，因此在進(jìn)一步臨床應(yīng)用前還應(yīng)在動(dòng)物模型基礎(chǔ)上嚴(yán)謹(jǐn)評(píng)估ADSCs的安全性及長期有效性。

3.2臨床研究 雖然目前關(guān)于ADSCs的研究逐漸增多，且ADSCs作為修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨損傷的方法在動(dòng)物模型中已顯現(xiàn)出積極效果，但涉及人類受試者的研究仍較少。Spasovski等[44]應(yīng)用濃度為(0.5～1.0)×107的ADSCs單次注射治療KOA患者，軟骨組織修復(fù)磁共振觀察評(píng)分結(jié)果顯示，患者膝關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)明顯，且疼痛、膝關(guān)節(jié)功能等均顯著改善。Koh等[45]通過關(guān)節(jié)鏡檢查發(fā)現(xiàn)，ADSCs(4.04×106個(gè)細(xì)胞)具有軟骨再生促進(jìn)作用。Jo等[46]通過隨機(jī)雙盲臨床研究證明，使用自體ADSCs治療膝關(guān)節(jié)軟骨缺損具有積極作用，治療后軟骨缺損區(qū)域的軟骨厚度增加，且有光滑的新生軟骨生成；此外，ADSCs注射劑量與關(guān)節(jié)軟骨再生量相關(guān)，1.0×108的ADSCs注射劑量可以更好地改善膝關(guān)節(jié)疼痛與功能障礙。但有研究指出，患者臨床癥狀改善可能與ADSCs分泌的具有抗炎、免疫等功能的細(xì)胞因子或旁分泌有關(guān)，經(jīng)ADSCs注射治療后受試者的膝關(guān)節(jié)磁共振成像并未發(fā)生明顯改變[47]。這一研究結(jié)果得到了Pers等[48]的支持。由于目前的研究有限且不同的研究中ADSCs來源、治療方式以及評(píng)價(jià)方法不同，難以對(duì)各研究的結(jié)果進(jìn)行比較，研究結(jié)果以及最終結(jié)論存在爭議，未來仍需大樣本研究和長期隨訪以探究確切的軟骨修復(fù)證據(jù)。

關(guān)于ADSCs治療的安全性，Lee等[49]研究表明，關(guān)節(jié)內(nèi)注射ADSCs治療KOA可有效抑制軟骨損傷的發(fā)展，改善患者膝關(guān)節(jié)功能，且隨訪6個(gè)月未發(fā)生不良事件。但也有研究報(bào)道，脂肪采集手術(shù)后患者會(huì)出現(xiàn)輕微的不適和瘀傷，且經(jīng)ADSCs治療后部分患者仍存在疼痛、腫脹，且癥狀可持續(xù)3 d至4周[50]。此外，干細(xì)胞治療在臨床實(shí)踐中還可能出現(xiàn)畸胎瘤、免疫排斥反應(yīng)以及批次、劑量依賴性作用的非穩(wěn)定性等問題，均需謹(jǐn)慎對(duì)待[51]。雖然目前人體試驗(yàn)研究中ADSCs軟骨修復(fù)作用及安全性尚存在爭議，但不可否認(rèn)ADSCs療法為膝關(guān)節(jié)軟骨損傷患者提供了一種便捷的非侵入性治療方案。目前尚不清楚ADSCs在人體內(nèi)是直接通過修復(fù)軟骨組織起作用還是通過信號(hào)分子促進(jìn)軟骨修復(fù)，因此ADSCs在膝關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)中的作用機(jī)制、療效及長期安全性仍需進(jìn)一步研究。

4 小 結(jié)

組織工程化軟骨與宿主的完美結(jié)合是軟骨修復(fù)的終極目標(biāo)。雖然ADSCs具有多向分化潛能，但通過TGF-β超家族等外源性生長因子、特定培養(yǎng)基、物理因子環(huán)境等也可促進(jìn)ADSCs向軟骨細(xì)胞高效分化。此外，ADSCs還具有取材方便、產(chǎn)量較高、免疫原性較低等生物特性，為膝關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)提供了一種極有前景的治療方法。但由于目前相關(guān)臨床報(bào)道較少，其安全性和有效性還需更多高質(zhì)量的研究驗(yàn)證。未來的研究應(yīng)基于ADSCs的多重優(yōu)勢(shì)并以明確ADSCs成軟骨分化機(jī)制為基礎(chǔ)，深入探究體外ADSCs與生長因子及三維誘導(dǎo)環(huán)境之間的關(guān)系以及誘導(dǎo)成軟骨分化完全的措施，進(jìn)一步促進(jìn)ADSCs在膝關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)中的應(yīng)用。