王玉玲，張露露，周 珊，蔣 濤，蘭道亮，2，吉文匯

（1. 西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2. 青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，四川 成都 610041）

成纖維細(xì)胞是多種多樣的間質(zhì)細(xì)胞，通過產(chǎn)生復(fù)雜的細(xì)胞外基質(zhì)和通過生物物理和生物化學(xué)線索創(chuàng)造信號龕，參與組織的平衡和疾病的治療[1]. 由于其在機體內(nèi)廣泛存在、易于獲得、體外培養(yǎng)條件相對簡易、增殖速度快等優(yōu)勢，因此在物種資源保存、胚胎移植及體細(xì)胞重編程等方面有著廣闊的應(yīng)用前景.在心臟中心臟成纖維細(xì)胞(Cardiac fibroblasts，CFs)是數(shù)量最多的細(xì)胞類型[2]，約占心臟細(xì)胞總數(shù)的70%，對刺激心肌細(xì)胞增殖很重要，可合成及分泌膠原纖維、彈性纖維及有機基質(zhì)，能夠促進心臟正常發(fā)育. 因此心臟能夠作為獲取成纖維細(xì)胞的一個重要來源.

牦牛主要生活在高海拔地區(qū)3 000 ～5 000 米，以低氧低壓、寒冷干燥、紫外線強、食物匱乏為主，特殊的生存環(huán)境導(dǎo)致牦牛群體形成了獨有的高原適應(yīng)性、肺活量大、覓食能力強、代謝能力強的特點不僅能夠為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┠?、肉、毛等豐富的生產(chǎn)生活資料[3]，還是研究高原適應(yīng)性的理想模型[4].依據(jù)現(xiàn)有的文獻資料報道，目前在牦牛上未見有成體系的和商品化的細(xì)胞系，尤其是在牦牛上還未見較為有成熟的成纖維細(xì)胞系的報道，同時也未見有較為標(biāo)準(zhǔn)化的原代細(xì)胞分離培養(yǎng)和鑒定細(xì)胞系的方法，導(dǎo)致無法進一步開展牦牛分子生理層面相關(guān)的研究工作.鑒于此本研究以牦牛胚胎心臟作為成纖維細(xì)胞系的來源，通過建立牦牛心臟原代成纖維細(xì)胞系，并對其細(xì)胞外型以及分子學(xué)進行相關(guān)的鑒定，為今后牦牛進一步基礎(chǔ)性生理等一系列研究提供可靠的細(xì)胞系平臺.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

在成都某屠宰場采集胎牛，迅速將胎牛使用75% 乙醇沖洗之后，放入裝有1%雙抗的無菌生理鹽水以及冰袋的采樣冷藏箱中，并盡快送回實驗室.

1.1.2 主要試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基購自Gibco，胎牛血清 FBS 購自QuaCell，0.25%胰蛋白酶-EDTA 購自博士德，二甲基亞砜(DMSO)、蘇木精-伊紅染色試劑盒購自Solarbio，MTT 溶液、秋水仙素、姬姆薩染色液試劑盒、marker2000、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 ExonScipt RT SuperMix、PCR 試劑盒 2xAccuProof HiFi HotStart SuperMix、RT-qPCR 試劑盒2xFast SYBR Green qPCR Master Mix UDG 均購自蓉為基因.

1.2 方法

1.2.1 牦牛胚胎心臟成纖維細(xì)胞系的原代分離培養(yǎng)及傳代

將采集的胎牛泡在70% 的乙醇中進行體表消毒，之后將胎牛移至細(xì)胞房無菌環(huán)境中，用滅菌手術(shù)刀片剖開胎牛腹部，將心臟組織剪成小塊之后用PBS緩沖液清洗3 遍，裝入無菌1.5 mL 離心管中.將其剪成約1 mm3的組織塊后，均勻的擺放在T25 培養(yǎng)瓶中，各個組織塊之間有一定的距離便于原代成纖維細(xì)胞的生長.將成纖維細(xì)胞放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

待原代成纖維細(xì)胞在T25 培養(yǎng)瓶中生長至瓶底80% ～90%以上時，利用PBS 清洗3 次，使用胰酶消化15 s.在顯微鏡下觀察大部分的細(xì)胞呈現(xiàn)圓形并脫離皿底，以DMEM 為基礎(chǔ)培養(yǎng)液加入20% FBS 和1%的雙抗終止消化，以一傳三進行傳代培養(yǎng).

1.2.2 MTT 法檢測原代牦牛胚胎心臟成纖維細(xì)胞生長曲線

取對數(shù)生長期細(xì)胞，每孔中有1 ×104個細(xì)胞. 將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，每組設(shè)3 個復(fù)孔取均值，實驗重復(fù)3 次[5].在培養(yǎng)7 d 后直接使用細(xì)胞技術(shù)儀進行細(xì)胞計數(shù).

1.2.3 成纖維細(xì)胞形態(tài)的鑒定

利用HE 染色法鑒定細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞密度約80%時，PBS 洗滌3 次，使用胰酶消化細(xì)胞并將細(xì)胞接種于圓玻片上，放入6 孔板中進行培養(yǎng). 待細(xì)胞長滿約80%之后取出，使用PBS 清洗爬片，4%多聚甲醛固定 15 min，PBS 清洗 3 次.純水中浸泡 15 min，使用蘇木素染液染色20 min，自來水清洗.將爬片置入0.2%氨水溶液中彌染5 s，自來水中浸泡2 min 復(fù)藍.伊紅染色2 min，自來水清洗. 乙醇梯度脫水透明，滴加中性樹膠蓋玻片，顯微鏡下拍照記錄[6].

通過利用秋水仙素染色法對成纖維細(xì)胞染色體進行染色，待細(xì)胞密度約80%，加入秋水仙素培養(yǎng)4 h后離心留沉淀.進行低滲處理，預(yù)固定、固定、制片、封閉等常規(guī)細(xì)胞免疫熒光染色步驟，在光學(xué)顯微鏡下拍攝染色體圖片.

1.2.4 熒光定量方法檢測特異性標(biāo)記基因

通過文獻挑選出已報道的成纖維細(xì)胞系中的4 個特異性標(biāo)記基因:Vimentin、TGFβ-1、FSP-1、S100A4，并用GAPDH當(dāng)內(nèi)參基因進行校正，每個樣本進行3 次重復(fù).利用Primer5.0 軟件分別對這5 個基因設(shè)計PCR和熒光定量PCR 擴增引物的序列(表1).同時用NCBI中Primer-BLAST 在線比對工具檢測引物的質(zhì)量.

表1 引物信息Table 1 Primer information

以牦牛胚胎心臟成纖維細(xì)胞cDNA 為模版，利用普通 PCR 技術(shù)擴增Vimentin、TGFβ-1、FSP-1、S100A4、GAPDH基因. RT-PCR 反應(yīng)體系為 25 μL:2 × Accu-Proof HiFi HotStart SuperMixa 為 12.5 μL，cDNA 為2 μL，上游和下游引物各 1.25 μL(10 μmol/L)，ddH2O 為 8 μL.RT-PCR 反應(yīng)程序:98 ℃預(yù)變性 30 s；98 ℃變性 10 s，退火 30 s(表 1)，72 ℃延伸 30 s 共 35個循環(huán)，72 ℃延伸 5 min；4 ℃保存.

利用 RT-qPCR 技術(shù)對 Vimentin、TGFβ-1、FSP-1、S100A4 基因測定表達量. RT-qPCR 反應(yīng)體系為10 μL:2 × Fast SYBR Green qPCR Master Mix UDG 為5 μL，cDNA 為 1 μL，上游和下游引物各 0.2 μL(10 μmol/L)，ddH2O 為 3.4 μL，50 × ROX Reference Dye(optional)為 0.2 μL.RT-PCR 反應(yīng)程序:50 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性 2 min，退火 15 s(表 1)，60 ℃延伸30 s共 40 個循環(huán).

1.2.5 統(tǒng)計分析

采用 2-ΔΔct法對 RT-qPCR 得到的實驗結(jié)果進行計算，利用Graphpad prism 9 軟件繪制表達差異圖，利用SPSS 25 統(tǒng)計軟件，對實驗結(jié)果進行單因素方差分析和差異顯著性分析，所有實驗進行三次重復(fù).

2 實驗結(jié)果

2.1 牦牛胚胎心臟成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及傳代

使用倒置相差顯微鏡觀察，可以看出成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)典型的菱形或者網(wǎng)狀連接在一起，呈不規(guī)則的三角形或放射狀排列. 細(xì)胞貼壁生長5 ～6 d 觀察到長梭狀的細(xì)胞排列生長，胞體豐滿，胞質(zhì)均勻，核呈圓形或卵圓形(圖1).隨著培養(yǎng)時間的延長，待原代細(xì)胞長至80% ～90%時即可進行傳代，連續(xù)進行11 次傳代，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)基本能夠保持一致.

圖1 牦牛胚胎心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)(胰酶消化法，10 × ，5d)Fig.1 Morphology of yak embryonic heart fibroblasts in culture(Trypsin digestion method，10 × ，5d)

2.2 MTT 法檢測細(xì)胞生長曲線

P3 代牦牛胚胎心臟成纖維細(xì)胞生長曲線見下圖2.細(xì)胞生長趨勢呈現(xiàn)典型的“S”型生長，群體倍增時間約為6 h.傳代之后，細(xì)胞進入潛伏期(1 ～2 d)，這個時間大約持續(xù)24 h.之后的2 ～3 d 細(xì)胞進入對數(shù)生長期，此階段細(xì)胞分裂旺盛，細(xì)胞數(shù)量快速增長.第4 ～7 d，細(xì)胞進入平衡期，此階段細(xì)胞的數(shù)量維持不變，或是稍有下降，不再增長.該實驗表明，牦牛心臟成纖維細(xì)胞傳代之后依然保持旺盛的分裂和增殖能力.

圖2 P3 代牦牛心臟成纖維細(xì)胞生長曲線Fig.2 Growth curve of P3 generation yak heart fibroblasts

2.3 成纖維細(xì)胞形態(tài)分析

牦牛心臟成纖維細(xì)胞HE 染色結(jié)果表明，成纖維細(xì)胞呈漩渦狀排列，與周圍界限比較清楚，胞質(zhì)呈粉紅色，胞核呈藍紫色，本實驗染色效果可能由于脫水原因，染色效果不理想(圖3a、b).正常染色細(xì)胞應(yīng)該呈典型的梭形、菱形、不規(guī)則形或者多角形，隨著細(xì)胞的生長，細(xì)胞的形態(tài)變成了不規(guī)則的星形及編織狀外觀，呈現(xiàn)典型的成纖維細(xì)胞形態(tài).

圖3 成纖維細(xì)胞HE 染色(a)物鏡 40 × ，(b)物鏡 20 ×Fig.3 Fibroblast HE staining(a)objective lens 40 × ，(b) objective lens 20 ×

牦牛體細(xì)胞染色體核型為 2n =60，一共 30 對(圖4). 其中常染色體有29 對，性染色體有1 對，性染色體分別為XX 和XY.除了X 和Y 性染色體是亞中端著絲粒染色體外，其余常染色體均為近端著絲粒染色體.

圖4 心臟成纖維細(xì)胞中期染色體圖Fig.4 Mid-stage chromosome map of cardiac fibroblasts

2.4 熒光定量PCR 測定特異性基因表達量

利用 RT-qPCR 技術(shù)對TGF-β、FSP-1、S100A4、Vimentin這4 個基因在2 至7 代成纖維細(xì)胞中的表達量進行檢測，以GAPDH作為內(nèi)參基因進行校對.結(jié)果表明在上述幾代細(xì)胞中以上幾個基因均有表達且表達量穩(wěn)定.單因素方差分析結(jié)果表明，這幾個基因在不同代數(shù)細(xì)胞中的表達量沒有顯著差異(P＞0.05)(圖5)，因此這4 個基因可以以組合的形式鑒定其在牦牛心臟成纖維細(xì)胞中的表達.

圖5 心臟成纖維細(xì)胞不同代數(shù)標(biāo)記物的相對表達量(a):Vimentin 基因；(b):S100A4 基因；(c):FSP-1 基因；(d):TGF-β 基因Fig.5 Relative expression of different generation markers in cardiac fibroblasts(a):Vimentin gene；(b):S100A4 gene；(c):FSP-1 gene；(d):TGF-β gene

3 討論

在成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)中，主要使用的血清濃度有，10%、15% 以及20%. 本實驗選擇了20%的血清加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，觀察到原代細(xì)胞的生長速度快，組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)3 ～5 d 后已經(jīng)大致長滿培養(yǎng)皿皿底的80%左右. 而高美紅等人在牛的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的過程中其加入15%的FBS，但是該實驗的成纖維細(xì)胞使用組織塊培養(yǎng)法需要經(jīng)過17 d 才能夠長滿皿的80%左右[7]. 吉信閣等人在豬胎兒成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，利用組織塊法，在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加有10%的FBS，可以使成纖維細(xì)胞在7 d 內(nèi)大量的生長[8]. 經(jīng)過上述文獻的比較，本實驗選取的20%FBS，能夠使成纖維細(xì)胞的生長速率與細(xì)胞生長情況比上述實驗結(jié)果達到更好的效果，也為牦牛其他細(xì)胞系的建立提供了血清學(xué)依據(jù).

本實驗針對成纖維細(xì)胞系的生長情況進行了檢驗發(fā)現(xiàn)其符合基本的細(xì)胞生長規(guī)律.根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)牦牛胚胎心臟成纖維細(xì)胞胞體較大，多呈現(xiàn)紡錘形或者不規(guī)則三角形狀態(tài)，胞質(zhì)外有長短不一的突起，總體呈漩渦狀或者放射狀. 這與西藏牦牛[9]、延邊牛[10]以及天祝山牦牛[11]等其他牛屬動物的成纖維細(xì)胞形態(tài)一致. 有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠心臟成纖維細(xì)胞的偽足較多，部分細(xì)胞呈圓盤形、扇形[12]，這與本實驗牦牛心臟成纖維細(xì)胞的形態(tài)有所差異.由此可以證明牛屬動物的成纖維細(xì)胞外形差異較小，這可能是由于物種之間的差異.

羅惠娜等人選取了Vimentin基因針對金毛犬睪丸成纖維細(xì)胞進行檢測，F(xiàn) Strutz 等人對小鼠的成纖維細(xì)胞以及基因的上皮細(xì)胞基因進行了差異雜交，發(fā)現(xiàn)了對成纖維細(xì)胞具有相對特異性的新細(xì)胞內(nèi)基因FSP1.Edie C Goldsmith 等人通過RT-PCR、蛋白免疫印跡、免疫組化等方法，證明了在小鼠心臟成纖維細(xì)胞中通過標(biāo)記S100A4、FSP-1 基因能成功鑒定出小鼠胰腺癌模型中腫瘤微環(huán)境成纖維細(xì)胞群體[13]. 除此之外，Li Xiao 等人證明轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是兔肺臟成纖維細(xì)胞增殖和纖維化的標(biāo)志基因[14]. 就目前而言，暫未對成纖維細(xì)胞的標(biāo)記基因進行綜合檢測，因此本實驗首次將Vimentin、S100A4、TGF-β、FSP-1 這四個基因在牦牛心臟成纖維細(xì)胞中進行檢測，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)以上四個基因均能夠在牦牛心臟成纖維細(xì)胞中表達，說明本實驗分離的細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞系，進一步驗證了該四個基因可以以組合的形式對成纖維細(xì)胞進行鑒定.

4 結(jié)論

本實驗通過組織塊法分離培養(yǎng)了牦牛胚胎心臟原代成纖維細(xì)胞并進行了傳代，通過MTT 法對細(xì)胞活性進行了檢測，利用HE 染色法和秋水仙素核染色對細(xì)胞的外型進行鑒定，利用RT-qPCR 技術(shù)檢測了Vimentin、S100A4、TGF-β、FSP-1 四個基因在牦牛胚胎心臟成纖維細(xì)胞中的表達，成功建立了牦牛胚胎心臟原代成纖維細(xì)胞系，并驗證了該四個基因能夠以組合的形式鑒定成纖維細(xì)胞，為今后牦牛成纖維細(xì)胞的進一步研究奠定了基礎(chǔ).