梁佳龍，劉飛遠，孫智勇，劉建青

0 引 言

高原地區(qū)強紫外線輻射導致各類皮膚問題嚴重影響、困擾駐地群眾、官兵的身心健康和工作、生活質量。有研究報道，喀喇昆侖高原進駐官兵皮膚患病率高于平原地區(qū)進駐者，達到54.29%[1]。誘發(fā)紫外線損傷的因素眾多，其中核因子κB蛋白(NF-κB)是其中之一。NF-κB蛋白作為細胞中的核轉錄因子[2-3]，通常在細胞質中，以二聚體的形式存在[4]，處于非活化態(tài)。機體在受到細菌、病毒感染[5]，紫外線照射[6-7]，發(fā)生免疫、炎癥和應激反應時[8]，抑制物I-κB可被激活并被泛素依賴性蛋白酶所降解[9-10]，從而釋放出NF-κB，其進入細胞核內可以激活靶基因的轉錄[11]，影響細胞的分化和發(fā)育[12]，誘發(fā)細胞的無限增殖從而導致癌癥。本研究旨在應用分子模擬技術尋找一種可以切斷NF-κB解離功能的先導化合物，為研發(fā)抗紫外線損傷藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 數據來源Studer等[13]課題組的研究發(fā)現一種內源性化合物具有NF-κB解離阻滯功能，其在蛋白質晶體結構資料數據庫(Research Collaboration for Structural Bioinformatics，Protein Data Bank，簡稱RCSB PDB)中編碼是6SH6。

1.2 實驗軟件使用Discovery Studio 3.5(DS3.5)軟件進行全部分子模擬計算。

1.3 藥效團模型的構建為提高藥效團模型對化合物數據庫篩選的精度和成藥性[14]，本研究藥效團模型以基于配體-受體相互作用模式進行構建。在DS3.5軟件中，π-π堆積的判斷條件為兩組結構幾何中心相互之間的距離在5.5?之內，且兩組芳香環(huán)幾何平面之間幾何中垂線夾角在50°以內，氫鍵的判斷條件為兩組結構幾何中心之間的距離在3.8?之內。

1.4 虛擬篩選使用加州大學舊金山分校(UCSF)的ZINC15數據庫進行數據庫構建，依據成藥五規(guī)則精簡化合物，應用DS3.5軟件中的build 3D 數據庫工具構建化合物數據庫，共得到10342180個符合成藥5規(guī)則的化合物的數據庫，從中再用藥效團模型進行虛擬篩選。

1.5 分子對接為確定分子對接的算法優(yōu)劣[15-16]，使用DS3.5軟件中的Ligandfit、CDOCKER、Libdock三種對接方法分別將6SH6晶體復合物結構中內源性小分子與受體蛋白質進行對接，驗證對接是否能重現6SH6中的結合作用模式，選用復現結合作用模式最佳的對接方法[17-18]，進行精密的分子對接實驗，以便將對接結果最好的化合物篩選出來。

1.6 分子動力學模擬將分子動力學模擬的起始狀態(tài)設定為1.5分子對接實驗中獲得的最優(yōu)結構，使用DS3.5軟件中的solvation算法模塊，模擬細胞質溶液中的狀態(tài)。使用標準動力學級聯(lián)(standard dynamics cascade，SDC)算法進行分子動力學模擬，設定溶液基準溫度為300K，動態(tài)過程選用升溫-平衡-降溫程序，平衡過程選用恒溫恒壓參數進行，采樣間隔2fs，動態(tài)模擬500ns中結合作用模式的動態(tài)變化過程。計算受體蛋白的各氨基酸的均方根漲落(root mean square fluctuation，RMSF)值。RMSF值表示在分子動力學模擬的過程之中氨基酸運動的自由程度。在DS3.5軟件之中，RMSF的計算原理是將氨基酸中的各原子作為一個整體，計算其在分子動力學模擬的整體時間之中偏移距離平方之和隨時間平均的平方根。

2 結 果

2.1 內源性NF-κB解離阻滯化合物結合作用模式和藥效團模型為尋找具有潛在阻斷NF-κB解離過程的藥物分子，本研究通過對6SH6晶體結構解析可知，其與受體蛋白之間可以形成多組相互之間作用，其三維結構見圖1。其與I-κB蛋白之間相互作用，具體表現為：化合物的嘧啶并咪唑雜環(huán)于204Arg、401Phe共形成2組π-π堆積，距離分別為4.08 ?、4.48?，呋喃環(huán)上的羥基與431Asp形成1組氫鍵，距離為2.31 ?，兩個磷酸殘基則分別于163Gly、164Ser、165Gly、166Lys、167Thr、168Thr形成氫鍵相互作用，距離分別是2.67 ?、3.10 ?、3.10 ?、2.67 ?、2.97 ?、2.93 ?。據此相互作用關系，課題組共構建了6個藥效團的模型，分別包含了3組氫鍵受體、2組氫鍵供體和1組π-π堆積效應。

圖1 內源性NF-κB解離阻滯化合物與受體蛋白結合三維結構圖

2.2 粗篩結果使用ZINC15化合物數據庫對上述構建的藥效團模型進行篩選，共篩選出347個與藥效團模型相符合的化合物。

2.3 對接方法選定與對接結果對Discovery Studio3.5軟件中提供的3種不同分子對接方法(Ligandfit、CDOCKER、Libdock)進行預實驗的結果顯示，基于能量最低的CDOCKER方法在重復復合物晶體結構相互之間作用模式過程中表現最佳。因此上述通過藥效團模型篩選得到的347個化合物與6SH6蛋白受體進行的分子對接，決定選用CDOCKER的算法進行。除去所有原本存在于6SH6復合物晶體結構中的配體分子，將蛋白質中的氨基酸殘基全部補齊，并將其中的水分子去除，選用CHARMm力場作為分子對接的力場，對接區(qū)域范圍設定為原化合物中心區(qū)域半徑10?范圍，每個化合物對接結果均保留得分最高的10個構象。結果顯示：276號化合物在前10個打分最高的構象中占了60%，其中排名第一的化合物結構見圖2。

圖2 276號化合物與與受體蛋白結合三維結構圖

將內源性化合物與蛋白結合作用結構圖與本研究篩選得到的276號化合物與蛋白結合作用結構圖進行疊加，從中可見兩者處于同一蛋白活性口袋中，具有高度相似的結合作用模式，證實篩選結果有效。見圖3。

圖3 276號化合物(灰紅)、內源性化合物(綠色)與受體結合三維結構圖

276號化合物結構中的8個磺酸基團分別于Lys133, Arg 134，Gly 165，Thr 167，Thr 168，Arg 204，Thr 426, Ser 427，Thr 429，Asp 431，Arg475，分別形成了11組氫鍵，距離分別為2.85?、2.58?、2.39?、2.73?、2.48?、2.02?、2.53?、1.94?、2.90?、2.06?、2.08?。

2.4 分子動力學模擬結果276號化合物與6SH6的分子動力學模擬實驗持續(xù)約16 h，體系溫度維持在296.51～302.61 K之間。受體蛋白的各氨基酸的RMSF值見圖4。 276號化合物與受體蛋白結合部位的氨基酸RMSF值較小，關鍵作用部位的結合作用穩(wěn)定。

圖4 受體蛋白各氨基酸均方根漲落(RMSF)圖

3 討 論

NF-κB可被細胞活素、氧自由基、吸入性顆粒、促有絲分裂劑、有毒金屬、紫外線照射等激活，在皮膚癌的發(fā)生、發(fā)展和惡化之中起到了關鍵的作用。紫外線中的UVB照射皮膚后可促使皮膚內氧自由基形成，激活NF-κB，引起皮膚加速老化，皮膚腫瘤形成和免疫抑制反應導致急性皮膚曬傷。抑制NF-κB的活性，是化學藥物預防皮膚癌和抗紫外線損傷發(fā)展的關鍵。目前一些NF-κB抑制劑已經被運用于皮膚癌治療過程中，并取得了一定的效果。如何篩選出特異性強、不良反應小的NF-κB抑制劑是目前研究的關鍵。

盡管本研究得到的276號化合物在對接結果、動力學模擬等方面都展現出了其在抑制NF-κB解離方面可能具有一定的效果，但這種結果只是基于計算機模擬的結果，其真正是否具有藥理活性，還需要動物實驗來進行驗證，但新藥研發(fā)是一個長期且投入巨大的工作過程，而利用計算機的輔助篩選技術可以大大降低研究的時間和成本，提高新藥發(fā)現的概率，而且隨著學術界對NF-κB的蛋白質晶體結構的深入廣泛研究，在一定程度上為我們發(fā)現NF-κB解離阻滯化合物方面，在篩選的準確性方面，提供了有力的保障。

與Studer等[13]課題組發(fā)現的內源性解離阻滯化合物相比，本研究中篩選得到的可能具有解離阻滯作用的276號化合物，兩者與蛋白的相互作用都是靜電相互作用，且都是電中性。雖然靜電相互作用是這類分子與蛋白相互作用的關鍵，但從本研究篩選結果以及Studer等[13]課題組的研究結果看，化合物極性可能不是這類藥物篩選的關鍵，但為了確保篩選結果的準確，后期本研究將對化合物不同極性的結合作用效果進行進一步驗證，以期得到更好的先導化合物。

本研究得到的276號化合物是基于分子模擬技術的藥物理性設計結果，其是否具有NF-κB解離阻滯效果還需要進一步的活性試驗。后續(xù)可對6SH6蛋白進行定點突變，對Lys133, Arg 134，Gly 165，Thr 167，Thr 168，Arg 204，Thr 426, Ser 427，Thr 429，Asp 431，Arg475等氨基酸位點進行定點突變，觀察其余受體蛋白結合的程度從而初步判斷276號化合物的生物活性。

通?？诜幬锓肿拥南鄬Ψ肿淤|量不超過500，而276號化合物約為965.87，且其結構之中包含多個磺酸基的結構，在化合物成藥性上存在一定的不足。之所以在打分系統(tǒng)中沒有將相對分子質量低于500納入打分系統(tǒng)，主要考慮在虛擬篩選過程中，化合物之間相互作用的穩(wěn)定性更顯得尤為重要。雖然化合物相互作用穩(wěn)定性強且相對分子質量低于500的化合物是最理想的篩選結果，但從本研究中篩選得到的347個先導化合物中，相對分子質量低于500的先導化合物與受體蛋白之間的結合作用模式均弱于Studer MK課題組中的內源性化合物，因此本研究中保留了部分相對分子質量大于500的化合物結構。后期，在確保結合作用模式不減弱的情況下，課題組將重點考慮對276號化合物的結構進行改造，如考慮削減磺酸基基團，運用質量較輕且結構類似的基團進行替代，以改善其在體內的ADMET(Absorption吸收、Distribution分布、Metabolism代謝、Excretion排泄、Toxcity毒性)性質。

對于NF-κB解離阻滯化合物的研究，本課題組在現有研究基礎上，下一步將對得到的276號化合物開展更為深入的理論研究，如：分子軌道能量、關鍵氨基酸殘基的能量差異以及作用力特征等信息，從而對新藥研發(fā)提供更多的理論支撐，此外建立紫外線損傷大鼠動物模型，盡早開展動物活性實驗也是必不可少的工作。

本研究通過構建NF-κB的抑制蛋白I-κB與內源性配體之間的藥效團模型，使用分子對接、動力學模擬技術，找到具有可能具有抑制NF-κB解離作用、可用于抗紫外線損傷的先導藥物。通過對該先導化合物的結合作用模式進行分析、分子動力學模擬實驗，顯示276號化合物與I-κB蛋白可以形成穩(wěn)定的作用模式，從而阻斷NF-κB的解離。因此，276號化合物可能是潛在的NF-κB解離阻滯化合物，可能具有抑制外界刺激下細胞的無限增殖等癌變過程的效果。