孫大偉，黃 健，耿建祥，趙光明，劉 標，王晨亮，張守成，葉曉霞，楊永國

0 引 言

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)是一類龐大異族性家族微小的環(huán)狀DNA病毒，它們主要通過性傳播的方式感染人體的黏膜和皮膚上皮細胞，引發(fā)人類的各種良、惡性病變。臨床上，HPV可分為高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus, HR-HPV)和低危型人乳頭瘤病毒(low-risk human papillomavirus, LR-HPV)兩類，一般LR-HPV常誘發(fā)人體的低級別上皮內瘤變、生殖器疣類病變等，而HR-HPV則可導致人體的高級別上皮內瘤變、癌性病變[1-4]。因HPV型別眾多，其分布存在著種族和地域的差異性，分析我國各地女性生殖道的尖銳濕疣、上皮內瘤變、癌性病變組織中HPV感染型別及出現(xiàn)頻率次數(shù)，有利于此類患者疾病的診斷、治療及隨訪。本研究對女性生殖道上皮6種病變組織中HPV感染型別的排序及分布狀況進行分析?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2000年1月至2021年3月南京市婦幼保健院、南京市大廠醫(yī)院、南京市中醫(yī)院、南京市江寧醫(yī)院、南京市梅山醫(yī)院、常熟市中醫(yī)院、靖江市人民醫(yī)院、揚州市洪泉醫(yī)院、蘇州市第九人民醫(yī)院、徐州市沛縣人民醫(yī)院、蘇州市市立醫(yī)院東院、揚州市江都人民醫(yī)院、九江市第一人民醫(yī)院、安慶市第一人民醫(yī)院、馬鞍山市中心醫(yī)院、當涂縣人民醫(yī)院、寧波市鄞州人民醫(yī)院、樂清市婦幼保健院、臨沂市腫瘤醫(yī)院病理科的病理組織形態(tài)學診斷為女性外陰尖銳濕疣患者248例，年齡為14～69歲，平均31.02歲；宮頸尖銳濕疣患者144例，年齡為19～75歲，平均32.86歲；宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)1級病變患者281例，年齡為24～71歲，平均43.71歲；CIN2級病變患者172例，年齡為24～70歲，平均44.27歲；CIN3級病變患者209例，年齡為23～74歲，平均43.60歲；宮頸鱗癌患者456例，年齡為25～87歲，平均53.03歲；共計1510例女性生殖道上皮6種病變患者。由一位病理科副主任醫(yī)師和一位主治醫(yī)師根據(jù)WHO(2003年)婦科腫瘤組織學的分類標準進行復片，并復習其臨床病理資料。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑PCR儀為美國Life Technology公司生產的ABI7500型，高速冷凍離心機為德國eppendorf公司生產的5810 R型，-20 ℃冰箱由青島海爾有限公司生產。26種HPV基因分型檢測試劑盒(用于科研)由湖南省圣湘生物技術有限公司提供。

1.2.2 標本的采集先除去所有受檢的石蠟組織周圍多余的石蠟，再將其石蠟組織切成厚約10 μm的蠟片，切5～8片。用無菌性鑷子將蠟片夾入小離心管中，編號后待檢。隨后，用次氯酸鈉溶液的棉球對用過的刀片及鑷子各擦拭3次。

1.2.3 DNA的提取將所有裝有組織蠟片的待測小離心管取出，按照DNA提取說明書的實驗步驟，規(guī)范操作，分批提取DNA溶液。得到所有提取好的DNA溶液，分批從其DNA溶液中取5 μL液體，上熒光定量PCR儀，行DNA擴增，擴增完成后，讀取每一份檢測樣本的循環(huán)值(CT值)，CT值低于或者小于39為陽性值(分7個檢測管，其中6個管都有4個不同的熒光標記物代表不同的HPV型別，1個管有2個不同的熒光標記物代表不同的HPV型別再加上一個內標熒光標記物)。HPV檢測型別，低危型：6、11、40、42、43、44、54、55、57型，高危型：16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、67、68、73型。

表2 女性生殖道上皮6種病變患者的HPV感染人數(shù)[n(%)]

1.3 統(tǒng)計學分析HPV感染率及各種HPV型別的比例應用HPV分型統(tǒng)計軟件(由南京倍寧醫(yī)療器械有限公司提供)進行分析，對分析出來的相關數(shù)據(jù)，應用統(tǒng)計軟件包SPSS 13.0對相關數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，計數(shù)資料采用百分率(%)表示，采用χ2檢驗比較, 以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 女性生殖道上皮6種病變患者HPV感染的狀況女性生殖道上皮6種病變患者中26種HPV感染型別出現(xiàn)總頻率次數(shù)(低危型頻率次數(shù)、高危型頻率次數(shù)，對多型HPV感染者，各型別重復計算)見表1;HPV總感染率、單一型、多型、低危型、高低危型、高危型HPV感染人數(shù)及感染率見表2。

2.2 女性生殖道上皮6種病變患者中高危型HPV感染率的比較外陰尖銳濕疣患者、宮頸尖銳濕疣患者高危型HPV感染率分別與CIN1～3級病變、宮頸鱗癌患者的高危型HPV感染率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CIN1級病變患者高危型HPV感染率分別與CIN2級病變、CIN3級病變、宮頸鱗癌患者的高危型HPV感染率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CIN2級病變、CIN3級病變、宮頸鱗癌患者的高危型HPV感染率兩兩分別比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。從外陰尖銳濕疣、宮頸尖銳濕疣患者到CIN1級病變、CIN2級病變、CIN3級病變患者，再到宮頸鱗癌患者，隨著病變程度的增加，高危型HPV感染率也隨著增加。見表2。

表1 女性生殖道上皮6種病變患者HPV感染各型別出現(xiàn)頻率數(shù)(次)

3 討 論

HPV感染引起的女性生殖道上皮疾病主要包括疣性病變、上皮內瘤性病變、癌性病變。HPV感染的型別存在著種族和地域的差異性以及致疣、致瘤、致癌的型別、出現(xiàn)頻率次數(shù)和風險度不一樣[5-8]。因此，明確各地致疣、致瘤、致癌的HPV型別、出現(xiàn)頻率數(shù)和風險度排序的分布狀況，可為病理科醫(yī)師對女性生殖道尖銳濕疣的病因學診斷，也可為臨床婦產科醫(yī)師對宮頸癌的防治策略的制定提供幫助。在HPV感染性疾病中，不同HPV型別的研究是以其病變組織標本中檢出的HPV型別結果作為評判標準的。對女性生殖道上皮病變組織行26種HPV分型檢測，對其疾病的早期篩查、診斷、治療、隨訪都有著積極的重要意義。

丹麥一項(Kjaer,2010年)對22～23歲和40～50歲初篩時宮頸細胞學正常，HPV檢測陽性女性經10年隨訪，其發(fā)生CIN2級以上病變患者分別為13.6%、21.2%，其主要HPV感染型別為16、18、31、33型，CIN3級中有12%以上患者會進展為宮頸浸潤性癌[9]。本研究女性生殖道上皮6種病變中前9位HPV感染型別出現(xiàn)頻率次數(shù)：外陰尖銳濕疣依次為11、6、16、18、52、43、51、42、33型；宮頸尖銳濕疣依次為11、6、16、52、33、18、40、54、44、55型；CIN1級依次為16、58、52、18、33、6、53、51、31、56、59型；CIN2級依次為52、16、58、31、33、18、53、35、51型；CIN3級依次為16、58、52、33、31、51、18、6、53型；宮頸鱗癌依次為16、18、52、58、31、33、59、39、11型。女性生殖道上皮6種病變中除了CIN2級外，前9位HPV型別出現(xiàn)頻率次數(shù)中都有低危HPV型別，一般來說，低危HPV型別主要是致疣、致瘤。本研究尖銳濕疣組織中以低危HPV6型和11型感染為主，11型明顯多于6型，分別排名前兩位；CIN1級病變患者中5例是由單一型6型、3例是由單一型11型引起的、CIN2級病變患者中2例是由單一型6型引起的、CIN3級病變患者中1例是由單一型6型引起的、宮頸鱗癌患者中未檢測出單一型6型和單一型11型。低危HPV6型和11型在人群中感染率是最高的，一般認為這兩型病毒只是引起良性病變。有研究表明，6型也具有增強子和轉化潛能，并已在惡性腫瘤中分離到，這是一個新的危險信號。CIN1級至CIN3級病變患者中，均有單一型6型被檢出，說明HPV6型是一個具有轉化潛能的增強子，可引起女性生殖道上皮細胞的瘤變或癌變[10]。本研究尖銳濕疣患者中，6型和11型是感染的優(yōu)勢病毒，以11型為主，與國外報道尖銳濕疣中以6型為主[11]的研究結果不同，提示6型和11型感染比例在尖銳濕疣患者中存在著種族地域的差異性，6型可單獨誘發(fā)高級別CIN，應引起婦科醫(yī)師重視和關注。隨著女性生殖道上皮病變程度的增加，高危HPV16型和18型感染率也隨著增加，尤其在宮頸鱗癌患者中，16型和18型依次排名前兩位，16型為最優(yōu)勢病毒。與國外報道宮頸鱗癌中以16、18、31、33型為主不同[9,12]。本研究結果表明在宮頸鱗癌患者中52、58型排在31、33型之前，59、39型排在45型(國外排序第3位)之前。提示我國臨床婦產科醫(yī)師在診治HPV感染的女性生殖道疾病時，除關注和追蹤16型和18型感染外，也要關注52、58、31、33、59型、39型。

目前，我國的三級和二級醫(yī)院中，主要使用的是21種或23種HPV分型檢測技術(低危HPV型別6種，分別為6、11、42、43、81、83型)，本研究采用的是26種HPV分型檢測技術(低危HPV型別9種)。本研究宮頸尖銳濕疣患者中，1例被檢出低危44+54型，外陰尖銳濕疣患者中，2例被檢出低危40型，1例被檢出低危54型，這4例尖銳濕疣患者被檢出的低危型別都不在以上6種低危型別檢測范圍之內(這4例尖銳濕疣患者使用了以上一般為6種低危HPV分型檢測結果都為陰性)?？梢娽槍ε陨车兰怃J濕疣患者開展26種HPV分型檢測，將有利于病理科醫(yī)師，對女性外陰和宮頸尖銳濕疣的診斷，也有利于臨床婦科醫(yī)師，對女性外陰和宮頸尖銳濕疣的治療以及對伴有高危HPV型別感染者的追蹤和隨訪工作。本研究說明我國目前用于女性外陰和宮頸尖銳濕疣患者的HPV分型檢測技術，存在著少數(shù)漏檢現(xiàn)象，值得我們進一步擴大對女性外陰和宮頸尖銳濕疣患者進行26種HPV分型的深入研究。

根據(jù)HPV的屬種分類原則，同一屬種的HPV型別之間會有相同或相似的分子特點和致病屬性。a-PV屬第9種中有16、31、33、35、52、58、67型7個成員，這7個成員都屬于高危型，可引起人體上皮的癌變，是一類值得高度關注和深入研究的高危型屬種，前6位型別被我國選入申報的13種高危型HPV檢測試劑中，除35型外，有5個型別(16、31、33、52、58型)被選為國際上廣泛接種的九價預防性HPV疫苗之中，可見第9種的HPV型別是宮頸鱗癌篩查和預防的非常重要的一大類。此第9種中唯一被冷落的就是67型。從本研究宮頸鱗癌患者中檢出的高危HPV型別出現(xiàn)頻率次數(shù)分析來看，67型在宮頸鱗癌患者中，以6+67型、67型、67型、67型、67型和11+35+67型感染方式出現(xiàn)了6次，除11+35+67型以多型方式與35型協(xié)同致癌外，其他5次都是主要致癌因子，其出現(xiàn)頻率次數(shù)位于高危型感染出現(xiàn)頻率次數(shù)排名第十位(見表1)，緊隨45型之后(45型出現(xiàn)頻率為7次)。由于九價預防性HPV疫苗對我國宮頸鱗癌保護譜為90.82%[3]?？梢婋S著我國九價預防性HPV疫苗，在女性群體中的廣泛接種，會使得此疫苗中的7種高危HPV型別，其致癌率從目前的90.00%以上降到10.00%以下。這樣就會導致現(xiàn)次要出現(xiàn)頻率次數(shù)的高危HPV型別強勁反彈，從而出現(xiàn)高危HPV型別的重新分布。本研究提示在宮頸鱗癌患者中，59型(13次)、39型(9次)、67型(6次)是一個值得臨床醫(yī)師高度重視和關注的潛在的致癌型別，可能是后疫苗時代，HPV型別重新分布后幾個重要的型別。

綜上所述，男女通過性生活，可將HPV從女性的外陰輸送至宮頸，引起的女性生殖道上皮不同的HPV感染性疾病。對女性外陰和宮頸尖銳濕疣患者開展26種HPV分型檢測，一可明確尖銳濕疣的診斷，減少患者的漏檢，以便婦科醫(yī)師開展該病的針對性治療，二可對伴有高危HPV型別感染的尖銳濕疣患者進行密切隨訪，以防止高危HPV型別引起女性生殖道上皮內瘤變和癌變。明確宮頸鱗癌組織中，高危HPV型別的分布狀況，感染率，最常見致癌的HPV型別，對婦科醫(yī)師追蹤這些高致癌及高出現(xiàn)頻率的HPV型別感染者，對CIN患者診治、隨訪，具有現(xiàn)實的臨床指導意義。同時對我國9價預防性HPV疫苗的研制，具有重要的參考作用。隨著我國女性廣泛接種9價預防性HPV疫苗，現(xiàn)階段婦產科醫(yī)師在面對我國女性宮頸疾病患者時，即要重視高危HPV16、18、52、58、31、33型外，也要關注HPV59、39、45、67型。只有對我國女性生殖道HPV感染疾病患者，實行整體全面的HPV感染型別的管控，才能達到最佳的防治效果，造福于廣大的女性生殖道HPV感染相關疾病的患者[13-16]。