郝繼偉，王繼軍，任 靜，宋曉彪

(包頭市中心醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014030)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)的分化程度普遍較低，而且腫瘤發(fā)展比較迅速，早期的轉(zhuǎn)移及晚期復(fù)發(fā)往往導(dǎo)致患者死亡。所以，通過研究結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展和演變機制，根據(jù)疾病的發(fā)生和發(fā)展的機制，找到有效的分子標(biāo)志物，采取有效的措施進行預(yù)防及早期檢測，對于早期腫瘤患者進行有效治療具有重要的臨床意義。

DNA甲基化是腫瘤抑制基因啟動子區(qū)域的一種DNA修飾，是腫瘤常見的表觀遺傳學(xué)改變之一 。學(xué)界對于DNA甲基化在結(jié)直腸癌中的作用看法相對一致，認為對大多數(shù)結(jié)直腸癌而言，全基因組的低甲基化、原癌基因的高甲基化與未甲基化CpG島的重新甲基化這些特征通常是DNA甲基化的主要改變[1]。而 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作為人體內(nèi)主要的催化甲基物質(zhì)轉(zhuǎn)移過程的酶系,其活性的增加和改變與基因甲基化物質(zhì)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的不同之間存在密切相關(guān)性，因此，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在結(jié)直腸癌細胞組織中非正常地表達,也就成為了癌細胞早期分子及信號傳導(dǎo)過程中發(fā)生改變的主要分子機制之一。 結(jié)直腸癌的發(fā)生、進展及預(yù)后與DNA甲基化酶的基因的高表達水平密切相關(guān)[2]

目前對于DNMT3b在CRC中表達的研究不是很多。Real-time PCR法在分子生物學(xué)以及基因工程當(dāng)中運用很普遍，但在臨床當(dāng)中其檢測基因水平的運用不盡相同。本研究通過RT-PCR技術(shù)檢測CRC患者癌組織及癌旁正常組織中DNMT3b mRNA 含量，探討DNMT3b 在結(jié)直腸癌病變組織與癌旁正常組織表達情況及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源與病例選擇 選取我院2015年收治的結(jié)直腸癌患者20例?；颊咴谶M行標(biāo)本采集前均未接收放化療或其他的抗腫瘤治療，且采集的結(jié)直腸組織未經(jīng)任何生物化學(xué)處理。手術(shù)前已向病人或家屬說明實驗的用途和基本步驟，征得受試者本人(或家屬)同意，并簽署書面知情同意書。每位患者取樣2枚，即結(jié)直腸癌組織和相應(yīng)的癌旁正常組織(大小約1 cm×1 cm×1 cm)。20例患者臨床資料統(tǒng)計結(jié)果如下：所有病例確診為原發(fā)癌，且經(jīng)病理證實；男性結(jié)直腸癌患者10例，女性結(jié)直腸癌患者10例；年齡34～75歲，中位年齡61歲；臨床分期按結(jié)直腸癌診療規(guī)范指南中TNM標(biāo)準(zhǔn)(2010)，Ⅰ期3例、Ⅱ期6例、Ⅲ期7例、Ⅳ期4例。

1.2主要設(shè)備儀器及試劑 Rneasy MiNi Kit試劑盒、RNA 酶抑制劑 、TAKARA 反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、RNA引物、SYBR green 試劑盒、PCR儀。

1.3RT-PCR及real-time PCR 用 QIAGEN 公司購買的 RNeasy MiniKit 提取細胞總RNA,選用紫外分光光度計測量 RNA 純度、RNA 含量。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：將總RNA 2 μg加入0.5 mL Eppendorf 管中,random hexamer引物1 μL,用 DEPC水補足12 μL；70 ℃下孵育 10 min，立刻放入冰浴1 min；將5×RT反應(yīng)緩沖液 4 μL加入其中；將dNTP(10 mM)1 μL和DTT(0.1M)2 μL混勻，42 ℃下孵育5 min；之后再加入 SuperscripⅡRT 酶 1 μL,在 42 ℃下反應(yīng) 50 min；70 ℃下反應(yīng)15 min。得到cDNA 產(chǎn)物-20 ℃下保存。Real-time PCR：使用ABI 96孔板,每個孔依順序加入cDNA 1 μL，2×mix 12.5 μL,3′和 5′端引物(5 μmol/L) 各1 μL,無菌水9.5 μL,將其放入 ABI 7900 real-time PCR 反應(yīng)儀上進行實時反應(yīng),每個樣本設(shè) 3個復(fù)空。反應(yīng)參數(shù): 94 ℃預(yù)變性3 min,再進行92 ℃ 30 s； 54.5 ℃ 35 s；72 ℃ 30 s( 40 cycles)，最后 72 ℃延伸5 min停止反應(yīng)。

1.4引物 引物具體序列如下：(1)DNMT3B上游引物：5′-ACGGAAGACTCGATCCTCGTC-3′；(2)DNMT3B下游引物：5′-GTGTGTAGCTTAGCAGACTGG-3′；(3)GAPDH上游引物：5′-AGGTGAAGGTCGGAGTCA-3′；(4)GAPDH下游引物：5′-GGTCATTGATGGCAACAA-3′。

2 結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌組織DNMT3b mRNA及癌旁正常組織的表達情況 DNMT3b mRNA 在CRC組織中的平均相對表達量為(2.912±1.174)，在其周圍正常組織中為(0.658±0.123)，DNMT3b基因表達量之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2結(jié)直腸癌組織 DNMT3b mRNA表達與臨床分期的關(guān)系 TNM腫瘤分期分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的結(jié)直腸癌組織中DNMT3b 平均相對表達量分別為(3.254±0.652)、(3.303±0.553)、(3.433±0.658)和(3.487±0.357)。隨著惡性腫瘤分期的遞增，DNMT3B基因表達相應(yīng)增高，但其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)見表1。

表1 DNMT3b mRNA表達與臨床分期的關(guān)系

2.3結(jié)直腸癌組織DNMT3b mRNA表達與患者性別的關(guān)系 結(jié)直腸惡性腫瘤組織DNMT3b平均相對表達量在男性腫瘤患者為(3.447±0.423)，在女性患者平均表達量則為(3.082±0.301)，男性相較于女性高表達，其結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 DNMT3b mRNA表達與患者性別的關(guān)系

2.4結(jié)直腸惡性腫瘤組織中DNMT3b mRNA表達與患者年齡的關(guān)系 結(jié)直腸惡性腫瘤組織DNMT3b平均相對表達量在40歲及以上患者(為3.413±0.391)，在40歲以下患者為(3.262±0.482)，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 DNMT3b mRNA表達與患者年齡的關(guān)系

3 討論

以往的研究表明,正常細胞向癌細胞進展可能有DNMT3b的參與[3]。在結(jié)腸癌細胞系HCT116中的研究顯示，DNMT1和DNMT3b在HCT116細胞中明顯高表達。Beaulieii等在進行腫瘤細胞的凋亡實驗中發(fā)現(xiàn)，通過敲除特定的DNMT3a和DNMT3b在HCT116細胞中可導(dǎo)致腫瘤細胞的凋亡。 這些實驗表明，在惡性腫瘤細胞的生長和基因沉默中DNMT3b起到一定的抑制作用[4]。利用免疫組織化學(xué)染色(IHC)的方法，王正堯等[5]科研工作者對72例結(jié)直腸癌癌變組織與30例癌旁周圍正常組織中DNMT3b表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)DNMT3b在結(jié)直腸癌組織中的陽性細胞表達率為55.56 %，顯著高于正常結(jié)直腸組織黏膜的表達率23.33 %，兩者結(jié)果間差異有明確的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。GLOBOCAN 2012數(shù)據(jù)顯示[6]，世界男性結(jié)直腸癌發(fā)病746 298例，占男性惡性腫瘤發(fā)病總數(shù)的10.0 %；世界女性結(jié)直腸癌發(fā)病614 304例。而中國男性發(fā)病146 528例，死亡79 074例；中國女性發(fā)病106 899例，死亡60 342例。無論在世界還是在我國范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌的男性發(fā)病與死亡的例數(shù)均遠高于女性。兩者在發(fā)病率方面的差異可能與體內(nèi)的女性激素水平的高低有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[7]結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與激素水平失衡，如雌孕激素在體內(nèi)代謝的紊亂密切相關(guān)[8],口服避孕藥和雌激素替代治療方法可以降低結(jié)直腸癌發(fā)病，其原因可能與膽汁酸有密切相關(guān)[9]，女性激素通過各種代謝通路調(diào)節(jié)膽固醇, 進而影響相關(guān)膽汁酸產(chǎn)物。我們的研究發(fā)現(xiàn)DNMT3b mRNA表達在男性患者中較女性更高，原因可能是DNMT3b表達量的增加使ER啟動子甲基化，導(dǎo)致 ER 表達缺失，這可能是男性和女性結(jié)直腸癌發(fā)病率顯著差異的原因之一。

本研究中，結(jié)直腸癌組織DNMT3b mRNA表達在不同的病例TNM分期有依次增高趨勢，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。另外，DNMT3b mRNA表達，在患者不同年齡之間也無顯著性差異。本研究當(dāng)中，以40歲為分界線是因為結(jié)直腸癌在40歲以下發(fā)病少，而在40歲以后發(fā)病率逐漸升高，可能與接觸環(huán)境中的致癌因素有關(guān)[10]，這些致癌因素可能導(dǎo)致異常甲基化。研究表明，結(jié)直腸癌組織DNMT3b mRNA表達在不同的病例TNM分期以及患者不同年齡之間均無顯著性差異。結(jié)直腸癌癌變組織中高表達的DNMT3b mRNA，顯示其可能與結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展過程密切相關(guān)，因此可將DNMT3b作為該腫瘤的治療靶點，繼續(xù)研究并開發(fā)針對DNMT3b的藥物并將其應(yīng)用于臨床。