王 恒，鄒純才，鄢海燕

（皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002）

決明子為豆科植物決明Cassia obtusifoliaL.或小決明Cassia toraL. 的干燥成熟種子，其味甘、苦、咸，性微寒，善入肝、腎、大腸經(jīng)，具有清熱明目、潤(rùn)腸通便的功效［1-3］。決明子最早記錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在我國(guó)有悠久的使用歷史，也曾被原國(guó)家衛(wèi)生部列為藥食同源的中藥之一［4］，在醫(yī)療保健行業(yè)有著巨大的應(yīng)用潛力?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，決明子具有降血壓、降血脂、抗血小板聚集、免疫、保肝、明目、抗氧化、抑菌等藥理作用［5，6］，在臨床上有著廣泛的應(yīng)用，是中醫(yī)藥治療心腦血管疾病、高脂血癥、便秘的代表性藥物［7］。決明子含有蒽醌類、萘并吡喃酮類、脂肪酸類、多糖和氨基酸等許多成分，主要成分是蒽醌類化合物，約占1%［7-9］，同時(shí)也是決明子中發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)，有著保肝、抗氧化、抗突變等多種藥理活性［10］，受到藥學(xué)相關(guān)人員的重點(diǎn)關(guān)注。

《中國(guó)藥典》2020 年版一部對(duì)決明子蒽醌類成分如大黃酚、橙黃決明素的含量測(cè)定，是以甲醇為提取溶劑提取蒽醌類成分，并以稀鹽酸水解結(jié)合型蒽醌獲得總蒽醌，再以無水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）為定容溶劑并進(jìn)行含量測(cè)定。分析提取溶劑的價(jià)格、毒性及生產(chǎn)中大量提取的使用等情況，考慮決明子中游離蒽醌和結(jié)合型蒽醌共存的實(shí)際，結(jié)合《中國(guó)藥典》2020 年版以無水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）為水解后游離蒽醌類化合物的定量分析定容溶劑。本研究擬基于響應(yīng)面設(shè)計(jì)法結(jié)合中藥指紋圖譜技術(shù)考察不同濃度乙醇與乙酸乙酯（2∶1）混合溶劑對(duì)決明子總蒽醌化合物提取工藝的影響，明確決明子總蒽醌的最佳提取工藝參數(shù)，為后期決明子總蒽醌藥理藥效學(xué)的研究奠定藥效成分基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

FA2004B 電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；島津UV-20A 高效液相色譜儀（島津公司）；DZF-6090 型真空干燥箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；Heidolph-LR4010/4011 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)海道爾夫公司）；DF-I 集熱式磁力加熱攪拌器（常州榮華儀器制造有限公司）；KQ-250DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RHP-400A 型高速多功能粉碎機(jī)（浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司）。

1.2 材料

決明子（清炒品，北京同仁堂誠(chéng)安藥材有限公司，批 號(hào)：2019073103、2020011901）；橙黃決 明 素（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度：≥98%，批號(hào)：17032405）；大黃素（中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，≥98%，批號(hào)：D03-140210）；大黃酸（中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，純度：≥98%，批號(hào)：D05-140210）；大黃酚（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度：≥98%，批號(hào)：17032204）；大黃素甲醚（中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，純度≥98%，批號(hào)：D04-140210）；無水乙醇（安徽安特食品股份有限公司，批號(hào)：210307363604）、乙酸乙酯（上海展云化工有限公司，批號(hào)：20210220）均為分析純；甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20160129）、乙腈（江蘇永華化學(xué)科技有限公司，批號(hào)：20151102）為色譜純，水為去離子水。

1.3 方法

1.3.1 溶液的制備

1.3.1.1 決明子總蒽醌提取物的制備 取決明子粉末（過三號(hào)篩）約5.0 g，精密稱定，置250 mL 圓底燒瓶中，按一定液料比加入一定濃度乙醇與乙酸乙酯按2∶1（mL∶mL）混合的溶液，水浴回流提取3 次，每次至規(guī)定時(shí)間，抽濾，合并濾液減壓濃縮至一定體積，用60%乙醇洗出，水浴揮干溶劑，真空干燥（壓力?0.1 MPa，溫度70 ℃，下同）48 h，得決明子總蒽醌提取物。

1.3.1.2 決明子總蒽醌供試品溶液的制備 取“1.3.1.1”項(xiàng)下決明子總蒽醌提取物約0.5 g，精密稱定，加入稀鹽酸30 mL，水浴回流水解1 h，立即冷卻，用二氯甲烷萃取5 次，每次30 mL，合并二氯甲烷液，回收溶劑，殘?jiān)脽o水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）混合溶液洗出，轉(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中，并用無水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）混合溶液定容至刻度，得決明子總蒽醌供試品溶液，備用。

1.3.1.3 決明子總蒽醌參照溶液的制備 按《中國(guó)藥典》［1］制備決明子總蒽醌參照溶液。取決明子粉末（過三號(hào)篩）約5.0 g，精密稱定，精密加入甲醇500 mL，加熱回流2 h，放冷，抽濾，旋蒸至干，真空干燥，得決明子總蒽醌提取物（參照品）。取決明子總蒽醌提取物（參照品）0.5 g，精密稱定，加稀鹽酸30 mL，水浴水解1 h，立即冷卻，用二氯甲烷萃取5次，每次30 mL，合并二氯甲烷液，回收溶劑，殘?jiān)脽o水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）混合溶液使溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中，并用無水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）混合溶液定容至刻度，得決明子總蒽醌參照品溶液，備用。

1.3.1.4 對(duì)照品溶液的制備 取橙黃決明素、大黃素甲醚、大黃酚、大黃素、大黃酸5 種對(duì)照品適量，精密稱定，分別置于量瓶中，用無水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）配制成質(zhì)量濃度均為200 μg/mL 的對(duì)照品貯備液。再分別精密吸取5 種對(duì)照品貯備液適量，置于量瓶中，用無水乙醇-乙酸乙酯配制成質(zhì)量濃度為12 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

1.3.2 指紋圖譜的建立

1.3.2.1 色譜條件［11］色譜柱YMC-Pack ODS-A C18（250.0 mm×4. 6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為A（乙腈）-B（0.1%磷酸），梯度洗脫，分析時(shí)間100 min；0～15 min，65%～65% B；15～18 min，65%～68%B；18～23 min，68%～68% B；23～25 min，68%～65% B；25～45 min，65%～50% B；45～63 min，50%～45% B；63～85 min，45%～45% B；85～100 min，45%～10% B；柱溫為30 ℃；體積流量：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)287 nm。

1.3.2.2 精密度試驗(yàn) 取決明子粉末5.0 g，精密稱定，按“1.3.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5 次，記錄色譜圖。求得橙黃決明素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚保留時(shí)間的RSD 值依次為0.026%、0.033%、0.012%、0.017%、0.023%，峰面積的RSD 值分別為0.14%、0.081%、0.54%、0.24%、0.64%，說明方法精密度良好。

1.3.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批決明子粉末5 份，每份5.0 g，精密稱定，按“1.3.1.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按“1.3.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示橙黃決明素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（rela?tive standard deviation，RSD）值 依 次 為1.10%、1.30%、0.49%、0.68%、0.78%，峰面積的RSD 值分別為3.4%、3.2%、3.4%、3.0%、2.6%，表明該方法重復(fù)性較好。

1.3.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，按“1.3.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、3、6、9、12 h 進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示橙黃決明素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚保留時(shí)間的RSD 值依次為0.038%、0.047%、0.110%、0.014%、0.200%，峰面積的RSD 值分別為0.39%、0.97%、0.61%、0.22%、0.72%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

1.3.3 單因素試驗(yàn) 按“1.3.1.1”、“1.3.1.2”項(xiàng)下方法，取5 g 決明子粉末，精密稱定，提取3 次，分別考察液料比（5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1 mL/g）、提取溶劑（40%、50%、60%、70%和80%的乙醇與乙酸乙酯以2∶1 比例混合作為提取溶劑）及提取時(shí)間（15、30、45、60、75 min）對(duì)決明子總蒽醌提取率或每克決明子提取物相當(dāng)藥材量、5 個(gè)指標(biāo)成分（橙黃決明素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚）的峰面積歸一化值［Xi%＝（Ai/An）×100%，Ai為同一提取條件下同一樣品的5 個(gè)指標(biāo)成分的峰面積和，An為同一提取條件下同一樣品的共有峰峰面積和］及對(duì)照指紋圖譜相似度（“1.3.1.3”項(xiàng)下參照溶液所得指紋圖譜為參照?qǐng)D譜S1，以其與供試品溶液指紋圖譜生成的對(duì)照指紋圖譜相似度為準(zhǔn)，下同）的影響，并確定綜合評(píng)價(jià)（R）結(jié)果。

綜合評(píng)價(jià)（R）=決明子總蒽醌提取率（或每克決明子提取物相當(dāng)藥材量）×0.2+5 個(gè)指標(biāo)成分峰面積歸一化值×0.5+對(duì)照指紋圖譜相似度×0.3 式中，0.2、0.5 和0.3 為權(quán)重系數(shù)，反映各因素對(duì)綜合評(píng)價(jià)的貢獻(xiàn)。

1.3.4 Box-Benhnken 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝 根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以提取率、峰面積歸一化值、對(duì)照指紋圖譜相似度及綜合評(píng)價(jià)結(jié)果為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取液料比（A）、乙醇濃度（B）和提取時(shí)間（C）3 個(gè)影響因素，并利用De?sign-Expert 8.0 軟件設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)［12］，因素與水平表見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Tab 1 Factors and levels in Box-Behnken design

2 結(jié)果

2.1 指紋圖譜的建立及共有峰的確認(rèn)

按“1.3.1.2”項(xiàng)方法制備決明子總蒽醌供試品溶液，按“1.3.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)研制的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012.130723 版本）中，建立指紋圖譜。以“1.3.1.3”項(xiàng)下決明子總蒽醌參照溶液所得指紋圖譜為參照?qǐng)D譜S1，經(jīng)多點(diǎn)校正，Mark 峰匹配共確認(rèn)了16 個(gè)共有峰；利用決明子總蒽醌供試品中待鑒別組分色譜峰與橙黃決明素等5 種對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間的一致性，確認(rèn)了決明子蒽醌類提取物的5 個(gè)標(biāo)志物峰［13］，分別為橙黃決明素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚，見圖1。

圖1 決明子供試品溶液（A）與混合對(duì)照品溶液（B）的HPLC 圖Fig 1 HPLC chromatogram of Cassia seeds test solution（A）and mixed reference solution（B）

2.2 單因素對(duì)決明子總蒽醌提取效率的影響

2.2.1 液料比對(duì)綜合評(píng)價(jià)（R）的影響 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定提取溶劑為60%乙醇-乙酸乙酯（2∶1）混合溶液，提取時(shí)間90 m in，考察液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1 和25∶1（mL/g）時(shí)對(duì)提取率（%）、峰面積歸一化值（%）及對(duì)照指紋圖譜相似度的影響，并計(jì)算綜合評(píng)價(jià)（R）結(jié)果。見表2、圖2。

由表2、圖2 可知，液料比15∶1（mL/g）時(shí)，提取率（%）最高、峰面積歸一化值（%）最大；各組對(duì)照指紋圖譜相似度在0.950～1.000，說明各組共有峰數(shù)量保持一致，各共有峰峰面積受液料比影響未出現(xiàn)過大或過小波動(dòng)；決明子總蒽醌提取的綜合評(píng)價(jià)隨著液料比（mL/g）的提升而逐漸提高，在液料比15∶1（mL/g）時(shí)總蒽醌綜合評(píng)價(jià)得分達(dá)到最高0.514。之后隨著液料比的增加，總蒽醌綜合評(píng)價(jià)結(jié)果逐漸下降。因此，最佳提取液料比為15∶1（mL/g）。

表2 液料比對(duì)綜合評(píng)價(jià)的影響Tab 2 Effect of liquid-to-material ratio on comprehensive evaluation

圖2 液料比對(duì)決明子HPLC 指紋圖譜（A）及綜合評(píng)價(jià)（B）的影響Fig 2 Effect of liquid-to-material ratio on HPLC fingerprint spectrum（A）and comprehensive evaluation（B）of Cassia seeds

2.2.2 提取溶劑對(duì)綜合評(píng)價(jià)（R）的影響 確定液料比為15∶1（mL/g），提取時(shí)間為90 min，分別考察提取溶液為40%、50%、60%、70%和80%的乙醇與乙酸乙酯以2∶1 比例混合作為提取溶劑對(duì)每克決明子提取物相當(dāng)決明子生藥含量（簡(jiǎn)稱相當(dāng)生藥含量）（%）、峰面積歸一化值（%）及對(duì)照指紋圖譜相似度的影響，并計(jì)算綜合評(píng)價(jià)（R）。見表3、圖3。

表3 提取溶劑對(duì)綜合評(píng)價(jià)的影響Tab 3 Effect of extraction solvent on comprehensive evaluation

圖3 提取溶劑對(duì)決明子HPLC 指紋圖譜（A）及綜合評(píng)價(jià)（B）的影響Fig 3 Effect of extraction solvent on HPLC fingerprint spectrum（A）and comprehensive evaluation（B）of Cassia seeds

在本次提取溶劑的考察中，乙醇濃度從40%～80%，變化范圍較大。乙醇濃度低時(shí)，蒽醌苷類成分提取率會(huì)增大，而游離蒽醌提取率會(huì)降低，同時(shí)提取出的水溶性雜質(zhì)會(huì)顯著增大；乙醇濃度高時(shí)，蒽醌苷類成分提取率會(huì)降低，而游離蒽醌提取率會(huì)增大。因此，在本次提取溶劑的考察中，并不意味提取物的提取率越高，提取溶劑就越好，因?yàn)樵撎崛∥锏募兌任幢剌^高。因此，采用每克決明子提取物含生藥量作為指標(biāo)，通過極差化法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使數(shù)據(jù)落入［0，1］之間［14］。同時(shí)，應(yīng)考慮峰面積歸一化值（%）及對(duì)照指紋圖譜相似度等。

由表3、圖3 可知，70%乙醇時(shí)，每克決明子提取物相當(dāng)決明子生藥含量最高，但峰面積歸一化值并非最高。對(duì)照指紋圖譜相似度在0.985～0.999，說明各組共有峰數(shù)量保持一致，各共有峰峰面積受提取溶劑影響未出現(xiàn)過大或過小波動(dòng)。計(jì)算綜合得分，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，總蒽醌提取的綜合評(píng)價(jià)得分最高。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)綜合評(píng)價(jià)（R）的影響 確定液料比為15∶1（mL/g），提取溶劑為70%乙醇-乙酸乙酯（2∶1），分別考察提取時(shí)間15、30、45、60、75 min 對(duì)提取率（%）、峰面積歸一化值（%）及對(duì)照指紋圖譜相似度的影響，并計(jì)算綜合評(píng)價(jià)（R）結(jié)果。見表4、圖4。

在有關(guān)液料比、提取溶劑的考察中，提取時(shí)間參照了《中國(guó)藥典》2020 年版中決明子含量測(cè)定項(xiàng)下的提取時(shí)間，設(shè)置為90 min。該提取時(shí)間的設(shè)置雖不影響液料比、提取溶劑的考察，但研究發(fā)現(xiàn)，在提取3 次的基礎(chǔ)上，90 min 設(shè)置時(shí)間過長(zhǎng)。為此，設(shè)置提取時(shí)間的考察點(diǎn)為15、30、45、60 和75 min。

由表4、圖4 可知，不同提取時(shí)間點(diǎn)決明子總蒽醌提取率及峰面積歸一化值較為接近，其RSD 分別為2.1%和2.2%，對(duì)照指紋圖譜相似度均大于0.99。綜合評(píng)價(jià)在45 min 達(dá)到最高值，考慮到在30 和45min 時(shí)，總蒽醌綜合評(píng)價(jià)極為相近，且在后期響應(yīng)面優(yōu)化時(shí)，45 min 將作為考察時(shí)間點(diǎn)三水平上限時(shí)間點(diǎn)，因此選擇提取時(shí)間為30 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)決明子HPLC 指紋圖譜（A）及綜合評(píng)價(jià)（B）的影響Fig 4 Effect of extraction time on HPLC fingerprint spectrum（A）and comprehensive evaluation（B）of Cassia seeds

表4 提取時(shí)間對(duì)綜合評(píng)價(jià)的影響Tab 4 Effect of extraction time on comprehensive evaluation

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析 根據(jù)表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表，通過Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5，得到多元二次響應(yīng)面回歸模型。

建立決明子響應(yīng)面17 組試驗(yàn)HPLC 指紋圖譜，以“1.3.1.3”項(xiàng)下參照溶液所得指紋圖譜為參照?qǐng)D譜S1，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件對(duì)5 個(gè)指標(biāo)成分的峰面積歸一化值及對(duì)照指紋圖譜相似度進(jìn)行分析計(jì)算，結(jié)合決明子總蒽醌提取率，確認(rèn)其綜合評(píng)價(jià)（R）。由表5、圖5 可知，不同因素、水平組合條件下決明子總蒽醌提取率的變化范圍為20.956%～24.028%，峰面積歸一化值的變化范圍為32.643%～36.656%，說明提取工藝對(duì)決明子總蒽醌提取率及峰面積歸一化值影響較大；對(duì)照指紋圖譜相似度均大于0.99，說明不同提取工藝下各樣品與參照溶液在共有峰數(shù)量和峰面積總體評(píng)價(jià)上較為相似?；貧w模型方差分析結(jié)果見表6。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab 5 Response surface test design and results

表6 回歸模型方差分析Tab 6 Regression model of analysis of variance

圖5 響應(yīng)面17 組決明子HPLC 指紋圖譜Fig 5 Response surface analysis of 17 HPLC fingerprints of Cassia seeds

決明子總蒽醌提取綜合評(píng)價(jià)的二次回歸方程為：

由表6 可知，乙醇濃度（B）對(duì)總蒽醌的提取呈極顯著影響（P<0.01）。模型P<0.05，說明該回歸模型是可信的；失擬項(xiàng)P=0.1187>0.05，無顯著性差異，說明該模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度較高，存在的誤差小，可以用該模型來分析和預(yù)測(cè)決明子總蒽醌提取過程中各影響因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系。F可反映各因素對(duì)試驗(yàn)的影響大小，F(xiàn)值越大，表明該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響越顯著［15］，由F值可以發(fā)現(xiàn)，在所設(shè)定的三個(gè)因素中，每種因素對(duì)決明子總蒽醌提取效率的影響程度為乙醇濃度（F=23.27）>提取時(shí)間（F=0.59）>液料比（F=0.26）［16］。模型的殘差正態(tài)概率分析結(jié)果見圖6。由圖6 可知，模型的殘差正態(tài)概率基本分布在同一直線上，R2=0.9685，說明決明子總蒽醌綜合評(píng)價(jià)的實(shí)際測(cè)得值與模型預(yù)測(cè)值相差較小。

圖6 殘差的正態(tài)概率分布圖Fig 6 Normal plot of residuals

2.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 由Design-Expert 8.0 軟件繪制所3D Surface，可以直觀地分析各影響因素之間對(duì)響應(yīng)值的影響大小，響應(yīng)面坡度越陡峭，說明該因素交互作用越顯著［17］，見圖7。以綜合評(píng)價(jià)為指標(biāo)對(duì)決明子總蒽醌的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到的最佳提取工藝為液料比（A）=20∶1（mL/g），提取溶劑（B）=60% 乙醇-乙酸乙酯（2∶1）混合溶液，提取時(shí)間（C）=15.12 min。對(duì)優(yōu)化條件進(jìn)行5 組驗(yàn)證試驗(yàn)，決明子總蒽醌提取的綜合評(píng)價(jià)得分為0.528（RSD=0.45%），模型預(yù)測(cè)得分為0.531，與預(yù)測(cè)得分的相對(duì)誤差為0.58%，因此該回歸模型對(duì)決明子總蒽醌提取綜合評(píng)價(jià)的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確可靠。

圖7 各因素交互作用對(duì)決明子總蒽醌提取效果的影響Fig 7 Effect of the interaction of various factors on the extraction effect of total anthraquinone from Cassia seed

3 討論

將Box-Behnken 響應(yīng)面法用于中藥提取物提取工藝優(yōu)化的文獻(xiàn)較多，評(píng)價(jià)指標(biāo)有提取率、有效成分含量等，但未見有將Box-Behnken 響應(yīng)面法與中藥指紋圖譜技術(shù)結(jié)合用于中藥提取物提取工藝優(yōu)化的報(bào)道?！吨袊?guó)藥典》2020 年版一部中決明子的含量測(cè)定項(xiàng)下，以甲醇為提取溶劑，以無水乙醇-乙酸乙酯為大黃酚、橙黃決明素2 種蒽醌化合物含量測(cè)定樣品的定容溶劑。為此，從提取溶劑價(jià)格、毒性、提取率等各方面綜合衡量，本試驗(yàn)選擇以不同濃度的乙醇與乙酸乙酯（2∶1）混合溶液作為決明子提取物的提取溶劑，采用Box-Behnken 響應(yīng)面法結(jié)合中藥指紋圖譜技術(shù)優(yōu)化決明子總蒽醌的提取工藝。

Box-Behnken 響應(yīng)面法可以避免傳統(tǒng)整理統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)存在的弊端，并準(zhǔn)確找到最佳的反應(yīng)條件及靈敏考察各因素之間的相互作用［18］。中藥指紋圖譜是能夠表示中藥化學(xué)特性共有峰的圖譜。通過建立決明子指紋圖譜，經(jīng)Mark 峰匹配，確認(rèn)了其共有峰，說明在條件優(yōu)化過程中不會(huì)導(dǎo)致某一個(gè)成分的缺失，也不會(huì)有新的化合物生成。對(duì)照指紋圖譜相似度的計(jì)算是以“1.3.1.3”項(xiàng)下按《中國(guó)藥典》制備參照溶液所得指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，結(jié)合樣品溶液指紋圖譜生成對(duì)照指紋圖譜，對(duì)照指紋圖譜相似度較高且有所波動(dòng)。對(duì)照指紋圖譜相似度波動(dòng)說明提取條件主要影響共有峰的峰面積，即提取物中各成分的含量；對(duì)照指紋圖譜相似度較高說明提取工藝變化對(duì)各共有峰的影響具有一定的均衡性，不會(huì)因提取工藝變化使某個(gè)成分過高或過低，各成分峰面積均圍繞參照?qǐng)D譜相應(yīng)的峰面積波動(dòng)。

提取率是中藥提取物工藝優(yōu)化中常用的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，但提取率的設(shè)置要考慮提取物的極性及提取溶劑極性的變化情況。本研究是優(yōu)化決明子總蒽醌的提取工藝，而蒽醌及蒽醌苷是決明子總蒽醌的主要有效物質(zhì)［19］，二者極性不同。提取溶劑極性大，蒽醌苷等極性大的物質(zhì)的提取率會(huì)增大，而蒽醌提取率會(huì)降低；提取溶劑極性小，蒽醌苷等極性大的物質(zhì)的提取率會(huì)降低，而蒽醌提取率會(huì)增大。因此，在考察不同濃度乙醇-乙酸乙酯對(duì)提取工藝影響時(shí)，在保證指紋特征相似性及5 種主要指標(biāo)成分高含量的基礎(chǔ)上，采用每克決明子提取物含生藥量替代提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)之一更為合理可靠。

在綜合評(píng)價(jià)（R）的計(jì)算中，權(quán)重系數(shù)0.2、0.5、0.3 分別為提取率、指標(biāo)成分峰面積歸一化值和對(duì)照指紋圖譜相似度對(duì)綜合評(píng)價(jià)的貢獻(xiàn)。其中，橙黃決明素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚5 種游離蒽醌的峰面積歸一化值來自同一提取條件下同一樣品的橙黃決明素等5 種游離蒽醌的峰面積和與該樣品中16 個(gè)共有峰峰面積和的比值，這些數(shù)據(jù)來自該樣品的指紋圖譜，是對(duì)該樣品指紋圖譜數(shù)據(jù)處理的結(jié)果，能夠綜合直觀反映提取工藝對(duì)5 種指標(biāo)成分及16 個(gè)共有峰的影響，因此設(shè)置權(quán)重為0.5。指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，其可全面獲得中藥化學(xué)成分群的整體特征信息。本研究是以《中國(guó)藥典》制備參照溶液所得指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，結(jié)合樣品溶液指紋圖譜生成對(duì)照指紋圖譜，并計(jì)算其相似度，考察提取條件變化對(duì)對(duì)照指紋圖譜相似度的影響，因此在峰面積歸一化值權(quán)重設(shè)置的基礎(chǔ)上，設(shè)置對(duì)照指紋圖譜相似度的權(quán)重為0.3。

本研究對(duì)決明子總蒽醌成分的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，可為決明子藥效成分的深入研究與應(yīng)用提供參考與借鑒。

作者貢獻(xiàn)度說明：

本文設(shè)計(jì)思路、提供指導(dǎo)意見及論文審校由鄒純才及鄢海燕教授提供；具體實(shí)驗(yàn)過程、數(shù)據(jù)分析及論文撰寫由王恒完成。