呂 夢(mèng)，紀(jì)曉迪，劉珂珂，楊 丁，婁利霞，聶 波，趙久麗，吳愛明

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院/中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部和北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700）

心血管病高居我國(guó)城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位［1］，并且發(fā)病率持續(xù)升高，其中冠心病患病人數(shù)已達(dá)1 100 萬之多［2］。心肌梗死是冠心病的急危重癥，由于冠狀動(dòng)脈供給心肌的血液阻斷，造成部分心肌因嚴(yán)重的持久性缺血而發(fā)生局部壞死，隨著壞死區(qū)域的擴(kuò)大，心功能降低，心肌細(xì)胞大量凋亡，進(jìn)而出現(xiàn)嚴(yán)重的心力衰竭或并發(fā)心律失常而致死。研究表明，調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡對(duì)心肌梗死的治療有積極意義［3，4］。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動(dòng)死亡的過程，發(fā)揮著清除機(jī)體內(nèi)受損或多余細(xì)胞的作用，以維持組織器官及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，而凋亡異常也會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生［5］。機(jī)體內(nèi)主要存在外源性、內(nèi)源性及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激3 種細(xì)胞凋亡途徑，其中內(nèi)源性途徑作為主要的細(xì)胞凋亡傳導(dǎo)途徑在心肌梗死病理進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［6，7］。BCL-2 家族及Caspase 家族基因參與調(diào)控內(nèi)源性凋亡途徑，有研究發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注的心肌細(xì)胞中，BCL-2 家族中的BCL-2、BAX基因表達(dá)改變，激活Caspase 凋亡途徑啟動(dòng)因子Caspase-9 及執(zhí)行因子Caspase-3，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8-10］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)穩(wěn)心顆粒具有改善心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞纖維化、心室重構(gòu)等心臟保護(hù)作用［11，12］，但其內(nèi)在機(jī)制并不清楚，本研究旨在從BCL-2/BAX/Cas?pase 凋亡途徑基因調(diào)控角度深入研究穩(wěn)心顆粒發(fā)揮療效的分子機(jī)制，為促進(jìn)其臨床應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)別雄性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量（210±20）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司購入，許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 藥物及試劑 穩(wěn)心顆粒，規(guī)格5 g/袋（山東步長(zhǎng)制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10950026），酒石酸美托洛爾片，規(guī)格25 mg/片（阿斯利康制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H32025391），TUNEL 試劑盒（Pro?mega 公司，貨號(hào)G3250），蘇木素-伊紅（HE）染液（南京建成科技有限公司，貨號(hào)：D026-1），Trizol 試劑盒（Thermo Fisher Scientific，貨號(hào)：15596026），Real-time PCR 擴(kuò)增試劑盒（美國(guó)ABI 公司，貨號(hào)：4472897）。

1.1.3 儀器 超高分辨率小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)（加拿大VisualSonics 公司，型號(hào)：Vevo 2100），小動(dòng)物呼吸機(jī)（ALC-VBS），光學(xué)顯微鏡（德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)，型號(hào)DMC5400），徠卡全自動(dòng)封閉組織脫水機(jī)（型號(hào)：ASP300S），徠卡組織包埋機(jī)（型號(hào)：EG1150H），徠卡烤片機(jī)（型號(hào)：HI1220），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（型號(hào)：Stratagene Mx3000P），4 ℃低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo 公司，Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 采用心臟左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法建立心肌梗死大鼠模型［13］。1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，隨后左胸前區(qū)備皮，仰臥位固定于鼠板，氣管插管后連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，參數(shù)設(shè)置呼吸頻率80次/min，潮氣量0.7～0.8 mL。手術(shù)區(qū)皮膚消毒后，用眼科剪在左胸前區(qū)三四肋間逐層剪開皮膚、肌肉層，眼科鑷鈍性分離肋骨層，撕開心包膜后，充分暴露手術(shù)范圍，于左心耳下冠狀動(dòng)脈分叉處下約2 mm 行結(jié)扎術(shù)，肉眼可見結(jié)扎線下心肌組織缺血變白，隨后復(fù)位心臟、肋骨，逐層縫合肋骨層、肌肉層和皮膚。術(shù)后即刻心電圖可見ST 段抬高，術(shù)后24 h 心電圖可見病理性Q 波形成。

1.2.2 分組及給藥 術(shù)后24 h 心電圖見V3～V6、Ⅰ、AVL 導(dǎo)聯(lián)兼V1或V2導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)病理性Q 波為造模合格納入分組標(biāo)準(zhǔn)［14］。隨機(jī)分為模型組，美托洛爾組，穩(wěn)心顆粒低、高劑量組，另設(shè)只穿線不結(jié)扎的假手術(shù)組作為對(duì)照，每組8 只。各組大鼠給藥劑量通過等效劑量換算方法進(jìn)行折算，穩(wěn)心顆粒低劑量組（1.35 g/kg）及美托洛爾組（2.25×10-3g/kg）采用等效劑量，穩(wěn)心顆粒高劑量組給藥劑量（2.7 g/kg）為低劑量組的2 倍。術(shù)后24 h 灌胃給藥，每日一次，連續(xù)治療2 周。假手術(shù)組及模型組給予等體積去離子水。

1.2.3 超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 治療2 周后，采用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能。1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，心前區(qū)大范圍備皮，將大鼠固定于操作臺(tái)，選取胸骨旁左室短軸切面，由二維超聲引導(dǎo)M 型曲線進(jìn)行檢測(cè)，主要指標(biāo)包括大鼠左心室收縮末期前壁厚度（LVAWs）、收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）、收縮末期后壁厚度（LVPWs）、舒張末期前壁厚度（LVAWd）、舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、舒張末期后壁厚度（LVPWd）以及左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。所有測(cè)量值取3 個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期的平均值。

1.2.4 HE 染色 心臟超聲檢測(cè)后，進(jìn)行心臟組織取材，大鼠麻醉后，固定于鼠板，開胸后迅速取出心臟，在冰上低溫操作，用眼科剪剪去左心耳及右心房、右心室，于心臟最大橫截面處切取厚度4 mm 的組織塊，浸泡于4%多聚甲醛溶液中充分固定，使用全封閉組織脫水機(jī)進(jìn)行組織處理，而后進(jìn)行石蠟包埋和切片，片厚4 μm。HE 染色先將石蠟切片60 ℃烤片1 h，隨后使用二甲苯充分脫蠟、梯度乙醇下行，自來水沖洗5 min，蘇木素染色液染核8 min，自來水沖洗5 min，鹽酸酒精分化40 s，自來水沖洗返藍(lán)10 min，伊紅溶液染細(xì)胞質(zhì)8 min，自來水沖洗3 min，梯度乙醇上行脫水，二甲苯中透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測(cè)取大鼠梗死邊緣區(qū)心肌組織，采用Trizol 法提取心臟總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280，計(jì)算各組總RNA 濃度，參照試劑盒說明書配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。采用Real-time PCR 檢測(cè)目的基因相對(duì)表達(dá)水平，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)40 次。引物序列為：BAX（上游引物TTGCTA?CAGGGTTTCATCC， 下 游 引 物 GTC?CAGTTCATCGCCAAT）、BCL-2（ 上 游 引 物CAGAATCAAGTGTTCGTCAT，下游引物TC?GTTCTTCACCTCCACCATGA）、Caspase-9（上游引物GCCACTGCCTCATCATCAACAA，下游引物AGTCTTCATCTCCAGTATCC）、Caspase-3（上游引物GAATCCACGAGCAGAGTC，下游引物TCAACAAGCCAACCAAGT），HMBS（上游引物CCTATGTCTGGCTGTCAAG，下游引物CAACAACTCTGGTTCAATCTC），以HMBS 為內(nèi) 參［15］采 用2-ΔΔct法 計(jì) 算 各 目 的 基 因 的 相 對(duì) 表 達(dá)水平。

1.2.6 TUNEL 染色 根據(jù)TUNEL 試劑盒說明書，將石蠟切片置于烤片機(jī)上60 ℃烤片1 h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各15 min，梯度乙醇下行各5 min，充分脫蠟水化后，于固定液中固定15 min，PBS 漂洗后，加入20 μg/mL 的蛋白酶K 溶液室溫孵育10 min，PBS漂洗后，平衡液孵育10 min，之后滴加rTdT 孵育緩沖液，37 ℃孵育1 h，孵育結(jié)束后，終止液終止15 min，再用PBS 漂洗后，滴加抗熒光淬滅封片劑封片。在熒光顯微鏡下進(jìn)行圖像采集，在520 nm 激發(fā)光下觀察凋亡細(xì)胞核的綠色熒光，在460 nm 激發(fā)光下觀察正常細(xì)胞核的藍(lán)色熒光。采用ImageJ 計(jì)算凋亡細(xì)胞核及正常細(xì)胞核數(shù)目，計(jì)算各組細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)性分布的數(shù)據(jù)，用單因素方差分析，方差齊時(shí)組間比較用LSD法，方差不齊組間比較用Dunnett’s T3 法，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，均以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠超聲心動(dòng)圖結(jié)果比較

心肌梗死2 周后，模型組大鼠LVAWs、LVP?Ws、LVPWd 及LVEF 均 顯 著 減 少（P<0.05～0.01），LVIDs、LVIDd 顯著增加（P<0.05～0.01）；與模型組相比，穩(wěn)心顆粒低、高劑量組及美托洛爾組大鼠LVAWs、LVPWs、LVPWd 及LVEF 均顯著增加（P<0.05～0.01），LVIDs 顯著減小（P<0.01），穩(wěn)心顆粒低劑量組與美托洛爾組LVIDd 顯著減少（P<0.05～0.01）；LVAWd 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 各組大鼠超聲心動(dòng)圖結(jié)果比較（n=8，±s）Tab 1 Comparison of echocardiographic results of rats in each group（n=8，±s）

表1 各組大鼠超聲心動(dòng)圖結(jié)果比較（n=8，±s）Tab 1 Comparison of echocardiographic results of rats in each group（n=8，±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。

組別假手術(shù)組模型組穩(wěn)心顆粒低劑量組穩(wěn)心顆粒高劑量組美托洛爾組LVEF (%)84.36±0.84 29.81±4.08**54.19±6.02*#63.39±5.52##67.15±6.20##16.329 0.000 FP LVAWs (mm)3.52±0.15 1.82±0.11**2.81±0.15*#2.70±0.21*#2.95±0.30##19.551 0.001 LVIDs (mm)3.31±0.15 6.83±0.10**4.67±0.15*##4.27±0.36##3.68±0.46##11.152 0.000 LVPWs (mm)3.42±0.18 2.21±0.20**3.28±0.22##3.46±0.19##3.50±0.19##14.731 0.005 LVAWd(mm)2.07±0.12 1.60±0.16 1.86±0.12 1.64±0.15 1.95±0.16 1.989 0.118 LVIDd (mm)6.56±0.30 7.85±0.46*6.63±0.34#7.11±0.32 6.06±0.41##3.273 0.022 LVPWd (mm)2.51±0.21 1.84±0.13*2.48±0.12#2.37±0.09#2.70±0.26##3.380 0.019

2.2 各組大鼠心臟組織病理改變

HE 染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組可見心肌纖維呈長(zhǎng)條狀排列整齊，細(xì)胞核大小形態(tài)正常，胞漿染色均一，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠梗死邊緣區(qū)心肌纖維斷裂溶解，細(xì)胞核形態(tài)異常，細(xì)胞質(zhì)染色深淺不一，細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂；與模型組相比，各給藥組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)有所改善，病理改變減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠心臟組織病理改變（HE 染色，40×）Fig 1 Pathological changes of heart tissue of rats in each group（HE staining，40 ×）

2.3 各組大鼠凋亡相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的變化

建立心肌梗死模型2 周后，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠BCL-2mRNA 相對(duì)表達(dá)水平和BCL-2/BAX 比 值 明 顯 減 少（P<0.01），BAX、Caspase-9、Caspase-3mRNA 相對(duì)表達(dá)水平明顯增高（P<0.01）；藥物治療2 周后，與模型組相比，穩(wěn)心顆粒低劑量組BCL-2/BAX 比值明顯增加（P<0.05），BAX mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），穩(wěn)心顆粒高劑量組及美托洛爾組BCL-2mRNA 表達(dá)水平和BCL-2/BAX 比 值 顯 著 增 加（P<0.05，P<0.01），BAX、Caspase-9、Caspase-3mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P<0.05，P<0.01）。見表2。

表2 各組大鼠凋亡相關(guān)基因表達(dá)比較（n=8，±s）Tab 2 Comparison of apoptosis related gene expression of rats in each group（n=8，±s）

表2 各組大鼠凋亡相關(guān)基因表達(dá)比較（n=8，±s）Tab 2 Comparison of apoptosis related gene expression of rats in each group（n=8，±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。

組別假手術(shù)組模型組穩(wěn)心顆粒低劑量組穩(wěn)心顆粒高劑量組美托洛爾組Caspase-3 1.01±0.05 2.35±0.11**1.86±0.15**1.43±0.09*##1.53±0.18#16.446 0.000 FP BCL-2 1.02±0.07 0.60±0.06**0.82±0.07 0.94±0.04##0.85±0.10#13.635 0.009 BAX 1.03±0.09 1.62±0.05**1.37±0.06**#1.27±0.07*##1.25±0.07*##8.955 0.000 BCL-2/BAX 1.08±0.18 0.38±0.05**0.64±0.06*#0.76±0.07##0.69±0.10*#19.919 0.001 Caspase-9 1.05±0.12 1.61±0.07**1.40±0.10*1.30±0.11#1.19±0.10##4.335 0.006

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較

建立心肌梗死模型2 周后，與假手術(shù)組相比，模型組心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，穩(wěn)心顆粒低、高劑量組及美托洛爾組心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.01）。見圖2，表3。

表3 各組大鼠凋亡率比較（n=8，±s）Tab 3 Comparison of apoptosis rate of rats in each group（n=8，±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.01；與模型組相比，#P<0.01。

凋亡率（%）1.01±0.04 5.73±0.33*2.74±0.12*#1.46±0.04*#1.43±0.04*#143.245 0.000組別假手術(shù)組模型組穩(wěn)心顆粒低劑量組穩(wěn)心顆粒高劑量組美托洛爾組F P

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較（免疫熒光，40×）Fig 2 Comparison of cardiomyocyte apoptosis rate of rats in each group（immunofluorescence，40 ×）

2.5 穩(wěn)心顆粒發(fā)揮心臟保護(hù)作用的分子機(jī)制

穩(wěn)心顆粒調(diào)控心肌梗死大鼠BCL-2/BAX/Caspase 凋亡途徑基因表達(dá)，見圖3。

圖3 穩(wěn)心顆粒調(diào)控心肌梗死大鼠BCL-2/BAX/Caspase 凋亡途徑基因表達(dá)Fig 3 Wenxin granule regulates gene expression of BCL-2/BAX/Caspase apoptosis pathway in rats with myo?cardial infarction

3 討論

心肌梗死屬中醫(yī)學(xué)胸痹、心痛范疇，病機(jī)主要為本虛標(biāo)實(shí)，其中以氣虛血瘀為多見，中醫(yī)治療多采用益氣活血法［16］。穩(wěn)心顆粒由黨參、三七、琥珀、黃精、甘松五味藥組成，具有益氣養(yǎng)陰，活血復(fù)脈定悸之功效。研究表明穩(wěn)心顆粒可有效減少心梗后心律失常發(fā)生事件，發(fā)揮心臟保護(hù)作用［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支后，心肌血供阻斷，導(dǎo)致心肌缺血性壞死損傷，心室結(jié)構(gòu)及功能障礙，出現(xiàn)左心室室壁厚度變薄，左室內(nèi)徑增大，左室射血分?jǐn)?shù)降低，心臟病理學(xué)形態(tài)紊亂。以上心肌梗死大鼠模型的檢測(cè)結(jié)果與劉威威等［18］報(bào)道的臨床上心?；颊叩男呐K病理特征高度一致，基于此動(dòng)物模型進(jìn)行穩(wěn)心顆粒的藥理學(xué)研究具有較強(qiáng)的參考價(jià)值。與模型組相比，穩(wěn)心顆粒組大鼠心臟結(jié)構(gòu)功能及病理性損傷有明顯改善。本研究結(jié)果顯示，心肌梗死2 周后，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高，說明心肌梗死后處于缺血缺氧狀態(tài)的心肌細(xì)胞凋亡加重，可見心肌細(xì)胞凋亡在心臟病理性改變過程中發(fā)揮重要作用［19］，而心肌細(xì)胞的凋亡水平與抗凋亡及促凋亡因子的表達(dá)相關(guān)。本研究進(jìn)一步觀察心肌梗死大鼠BCL-2/BAX/Caspase 凋亡途徑基因表達(dá)變化及穩(wěn)心顆粒的心臟保護(hù)作用機(jī)制。

研究結(jié)果顯示，心肌梗死2 周后，模型組BCL-2 mRNA 表 達(dá) 水 平 及BCL-2/BAX 比值下調(diào)，BAX、Caspase-9、Caspase-3 mRNA 表達(dá)上調(diào)，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高，表明BCL-2/BAX/Caspase 是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的重要途徑，心肌梗死后，心肌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生凋亡信號(hào)（缺血、氧化應(yīng)激等），促凋亡基因BAX 及抗凋亡基因BCL-2 可通過調(diào)控線粒體外膜通透性，調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑，使線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）等物質(zhì)釋放至細(xì)胞質(zhì)中，激活Caspase-9 參與凋亡啟動(dòng)，進(jìn)而活化下游凋亡的執(zhí)行子Caspase-3，影響DNA 復(fù)制、降解凋亡抑制蛋白等，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡［20-23］，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞凋亡率增加，心臟病理性損傷加重，這是導(dǎo)致模型組大鼠心臟病理性變化的分子機(jī)制，此結(jié)果與占天為等［24］在心肌梗死大鼠中的凋亡研究相一致。而BCL-2 可抑制BAX 活性阻止其嵌入線粒體外膜上，進(jìn)而抑制Caspase 家族活性，發(fā)揮抗凋亡的作用，本研究結(jié)果證實(shí)穩(wěn)心顆粒能在基因水平調(diào)控上述過程從而抑制心肌細(xì)胞的過度凋亡。

綜上所述，穩(wěn)心顆粒能通過上調(diào)凋亡抑制因子BCL-2基 因 表 達(dá)，減 輕BCL-2/BAX/Caspase 凋 亡途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這是穩(wěn)心顆粒發(fā)揮心臟保護(hù)作用的分子機(jī)制之一。

本研究?jī)H局限在整體動(dòng)物水平對(duì)穩(wěn)心顆粒調(diào)控心梗大鼠心臟BCL-2/BAX/Caspase 凋亡通路基因表達(dá)進(jìn)行了初步探討，后續(xù)研究將進(jìn)一步從細(xì)胞水平和蛋白表達(dá)方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

作者貢獻(xiàn)度說明：

吳愛明：對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)造模以及文章審校；聶波，婁利霞：對(duì)實(shí)驗(yàn)提供技術(shù)指導(dǎo)；趙久麗：提供超聲心動(dòng)圖指標(biāo)檢測(cè)技術(shù)支持；呂夢(mèng)，紀(jì)曉迪，劉珂珂，趙久麗：負(fù)責(zé)藥物干預(yù)，指標(biāo)檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析；呂夢(mèng)：執(zhí)筆撰寫論文。