董家銘 吳康郁 袁德俊 張建環(huán) 徐姍姍 葉嘉麗 涂興明*

1. 廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510405 2. 廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510378 3. 廣州中醫(yī)藥大學順德醫(yī)院(佛山市順德區(qū)中醫(yī)院)，廣東 佛山 528300

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是一種以骨量低下，骨組織微結構損壞，導致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病，是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)的常見并發(fā)癥之一[1]。在我國，成人CKD患病率已超過10 %[2]。CKD與OP聯(lián)系密切，在20歲以上患有骨質(zhì)疏松的婦女中約有85 %存在腎功能損傷[3]。據(jù)國際腎臟病學會(ISN) 2017—2018 年度報告(https://www.theisn.org/wp-content/uploads/2020/09/ISN_biennial_report_2019.pdf)顯示，CKD 作為全球第 11大死因，每年約造成120萬人死亡，是全球第 6 大增長最快的死因。慢性腎臟病-礦物質(zhì)和骨異常 (CKD-MBD) 是 CKD 患者高死亡率的主要原因之一[4]。慢性腎臟病-骨質(zhì)疏松癥 (CKD-OP) 則是CKD-MBD 的進一步發(fā)展，其發(fā)病機制復雜，藥物治療策略上主要采取抗骨吸收藥物治療，然而，化學藥物在使用時存在不同程度的限制和不良反應[5]。中醫(yī)藥具有“多成分、多靶點、多途徑”的特點，在治療CKD及OP方面應用歷史悠久，具有獨特優(yōu)勢，且不良反應較少，潛在應用前景較大，但其治療機制尚需進一步明確。

肉蓯蓉始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，有填精補髓、補腎壯陽等功效[6]。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉不僅能治療骨質(zhì)疏松癥，還能有效地保護透析治療的CKD患者殘余腎功能，促進溶質(zhì)及水分清除，提高透析充分性且無明顯不良反應。此外，單味中藥肉蓯蓉在治療CKD與OP方面不僅具有一定的療效，而且不良反應較少，辯證相對簡單明確，還可作為茶飲發(fā)揮持久作用，有利于提高患者配合度，但其治療CKD-OP的雙效成分和作用機制尚不明確。研究肉蓯蓉治療CKD-OP的機制對闡明肉蓯蓉填精補髓、補腎壯陽的功效具有重要意義?；诖?，本研究運用網(wǎng)絡藥理學的方法探討肉蓯蓉治療CKD-OP的潛在雙效成分及作用機制，并利用分子對接技術驗證，以期為肉蓯蓉治療CKD-OP的臨床實踐提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 肉蓯蓉活性成分和相關靶點篩選

首先在TCMSP (Version：2.3，https://tcmspw.com/tcmsp.php)以“roucongrong” 為 “herb name” 進行檢索。按口服生物利用度(OB) ≥30 %，類藥性(DL) ≥0.18篩選活性成分和靶點，并通過中國知網(wǎng)(https://www.cnki.net/)和PubMed數(shù)據(jù)庫(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)補充因OB值<30 %或DL值<0.18而被篩掉但已有文獻報道具有活性的成分和靶點。隨后在Uniprot數(shù)據(jù)庫(2020年8月3日更新，https://www.uniprot.org/)進行靶點注釋，去除非人源及無數(shù)據(jù)靶點。最后在Cytoscape (Version：3.8.0)構建活性成分-相關靶點網(wǎng)絡。

1.2 CKD和OP共同靶標獲取

分別以“Osteoporosis”和“Chronic Kidney Disease”為檢索詞在DisGeNet (Version：7.0，https://www.disgenet.org/)、OMIM (2020年9月15日更新，https://www.omim.org/)、TTD(2020年6月1日更新，http://db.idrblab.net/ttd/)以及GeneCards(Version：5.0，https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫檢索OP和CKD相關的疾病靶點，將兩者的疾病靶點各自匯合去重后導入Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)網(wǎng)站取交集，即得CKD-OP共同靶點。

1.3 肉蓯蓉治療CKD-OP潛在靶點獲取

將肉蓯蓉活性成分相關靶點和CKD-OP共同靶點導入Venny 2.1網(wǎng)站，取其交集，即得。

1.4 PPI網(wǎng)絡構建

于STRING數(shù)據(jù)庫(Version：11.0，https://string-db.org/)輸入肉蓯蓉治療CKD-OP的潛在靶點，限定物種為“智人(Homo sapiens)”，并且設置分析條件為最高置信度(0.900)，隱藏孤立靶點即得。

1.5 核心靶點的篩選

利用CytoHubba插件對PPI網(wǎng)絡進行分析，從自由度(Degree)、介數(shù)(Betweeness)和接近中心數(shù)(Closeness)3個維度分析潛在靶點的重要性，以大于中位數(shù)為條件篩選，3個維度分別獲得的結果的交集即為核心靶點。

1.6 核心靶點GO功能和KEGG通路富集

通過DAVID數(shù)據(jù)庫(Version：6.8，https://david.ncifcrf.gov/)對核心靶點進行GO功能注釋和KEGG信號通路富集分析，物種和背景均選擇“智人(Homo sapiens)”，分析肉蓯蓉發(fā)揮治療CKD-OP藥理作用的P<0.05的前20個主要生物過程和非疾病命名、非癌癥相關信號通路，使用R語言ggplot2軟件進行繪圖，并于Cytoscape 將構建活性成分-核心靶點-信號通路圖。

1.7 關鍵成分的分子對接驗證

根據(jù)前面得到的活性成分-核心靶點-信號通路圖，選擇自由度≥5的活性成分作為關鍵成分，自由度≥10的核心靶點作為關鍵靶點。分別從PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和RCSB PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)下載結構文件，進行除水、除原配體、加氫、計算電荷等處理后，利用AutoDockTools進行關鍵靶點與關鍵成分的半柔性分子對接，設置盒子大小為X、Y、Z軸均為126，使用拉馬克遺傳算法，其他設置默認不變，選擇結合能最低的優(yōu)勢構象于PyMOL 2.3.0展示。

2 結果

2.1 肉蓯蓉活性成分篩選及活性成分-相關靶點網(wǎng)絡構建

TCMSP共篩選到7個活性成分，通過CNKI和PubMed數(shù)據(jù)庫補充4個活性成分，詳見表1。將活性成分和經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫標準化的173個相關靶點導入Cytoscape 中，得到圖1。

表1 肉蓯蓉活性成分Table 1 Cistanche Herba active ingredients

圖1 肉蓯蓉活性成分-相關靶點網(wǎng)絡圖Fig.1 Cistanche Herba active ingredients-related targets network

2.2 CKD與OP共同靶點

分別得到CKD和OP相關靶點14 979和4 629個，交集得到CKD-OP共同靶點3 846個(圖2)。

圖2 CKD-OP疾病相關靶點交集Fig.2 CKD-OP disease-related targets intersection

2.3 肉蓯蓉治療CKD-OP潛在靶點

將肉蓯蓉活性成分相關靶點與CKD-OP共同靶點映射，得到肉蓯蓉治療CKD-OP的潛在靶點132個(圖3)。

圖3 肉蓯蓉-疾病靶點交集Fig.3 Cistanche Herba-disease targets intersection

2.4 潛在靶點PPI網(wǎng)絡及核心靶點

潛在靶點PPI網(wǎng)絡圖(圖4)經(jīng)CytoHubba插件分析后，篩選出核心靶點46個(表2)。

圖4 肉蓯蓉潛在靶點PPI網(wǎng)絡圖Fig.4 Potential target PPI network of Cistanche Herba

2.5 核心靶點GO功能和KEGG通路富集

共獲得KEGG通路99條，主要涉及TNF、HIF-1、Toll樣受體等信號通路等，其中以TNF信號通路的P值最小，表明肉蓯蓉通過該通路影響CKD-OP的可能性較大。GO功能494條，包括生物學過程(BP)403條，主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、對藥物的反應、DNA模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等；細胞定位(CC)32條，主要涉及核、細胞外間隙、核質(zhì)等；分子功能(MF)59條，主要涉及相同的蛋白質(zhì)結合、轉(zhuǎn)錄因子結合、酶結合等。根據(jù)P值各列出最小的前20名，使用R語言繪制成柱狀圖和氣泡圖，如圖5和圖6，柱長和氣泡大小表示基因數(shù)量，顏色代表靶點富集顯著性P值，富集倍數(shù)Fold Enrichment表示核心靶點在該通路基因的占比。

表2 肉蓯蓉核心靶點Table 2 Cistanche Herba core targets

2.6 “活性成分-核心靶點-信號通路”網(wǎng)絡構建以及分子對接對象選擇

“活性成分-核心靶點-信號通路”網(wǎng)絡圖(圖7)顯示，得到關鍵成分3個(槲皮素、β-谷甾醇、紅景天苷)和關鍵靶點6個(AKT1、MAPK1、JUN、TNF、RELA和PTGS2)。

2.7 分子對接

肉蓯蓉關鍵成分與相應的關鍵靶點的結合能均小于-5 kcal/mol (圖8)。一般認為，配體與受體之間的結合能越低，其構象越穩(wěn)定，結合能≤-5 kcal/mol說

圖6 肉蓯蓉KEGG通路富集圖Fig.6 KEGG pathway Enrichment analysis of Cistanche Herba

注：黃色表示與PTGS2存在關聯(lián)的節(jié)點。圖7 活性成分-核心靶點-信號通路網(wǎng)絡圖Fig.7 Active ingredients-core targets-signal pathways network

圖8 肉蓯蓉關鍵成分的分子對接結果Fig.8 Molecular docking results of key ingredients of Cistanche Herba

注：A：β-谷甾醇+PTGS2；B：槲皮素+PTGS2；C：紅景天苷+PTGS2。綠色條帶為蛋白，粉色棍狀結構為藥物分子，黃色連線為氫鍵，數(shù)字代表其距離，其余棍狀結構為蛋白對接殘基。圖9 肉蓯蓉治療CKD-OP關鍵成分與PTGS2分子對接位點Fig.9 Key components of Cistanche for preventing CKD-OP and docking site of PTGS2

明兩者可以結合，≤-7 kcal/mol則表明兩者結合活性較好[9]。在6個靶點中，PTGS2是3個關鍵成分的共同靶點，且結合能均小于-7 kcal/mol，是6個關鍵靶點與關鍵成分中平均結合能最低的靶點(-9.416 6 kcal/mol)，其與β-谷甾醇形成3個關鍵成分和6個關鍵靶點之間的最優(yōu)構象。另外，由圖7可知，PTGS2還可被肉蓯蓉其他活性成分影響，表明PTGS2可能是肉蓯蓉影響CKD-OP的主要關鍵靶點，其主要對應TNF信號通路、NF-κB信號通路和Oxytocin 信號通路，該分子對接驗證結果與DAVID數(shù)據(jù)庫分析預測結果相符。PTGS2和槲皮素、紅景天苷、β谷甾醇的分子對接模型如圖9所示。

3 討論

隨著人口老齡化的進展以及人們生活方式的改變，OP和CKD的發(fā)病率逐年增加，成為了一個重要的公共衛(wèi)生問題，如何防范化解國內(nèi)約1.195億[10]CKD患者帶來的OP患病風險將可能成為“健康中國行動”背景下值得思考的課題。

CKD-OP的發(fā)病機制復雜，涉及范圍廣，單一化學藥物治療難度較大且存在不同程度的不良反應[11]。中醫(yī)藥治療腎臟疾病和骨病已有幾千年歷史，不良反應少、療效獨特的特點使其應用得到越來越多的關注，但具體分子機制尚未明確。本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法和分子對接技術發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉可通過β-谷甾醇、槲皮素、紅景天苷和AKT1、MAPK1、JUN、TNF、RELA和PTGS2影響CKD-OP，所涉及的信號通路主要有：TNF信號通路、NF-κB信號通路和Oxytocin 信號通路等，其中β-谷甾醇、槲皮素、PTGS2以及TNF信號通路可能是影響比較大的主要因素。

PTGS2也稱環(huán)氧合酶-2(COX-2)，是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為炎癥性前列腺素的主要同工酶，可影響CKD和OP的發(fā)病過程[12]。研究表明，槲皮素對破骨細胞的形成、增殖和成熟均有抑制作用，同時還能促進成骨細胞的生長，其機制與抑制PTGS2表達、抑制NF-κB激活、恢復TNF-α正常水平等有關[13]。此外，槲皮素還能通過抑制PTGS2、TNFα，調(diào)節(jié)MAPK和NF-κB信號通路保護腎臟，且呈劑量依賴性[14]。而紅景天苷也被證明可減少軟骨細胞PTGS2的表達，抑制NF-κB的激活[15]。在腎臟保護方面，紅景天苷能減少TNF-α的釋放，抑制NF-κB和MAPK信號通路，改善腎間質(zhì)纖維化[16]。β-谷甾醇則可降低TNFα、PTGS2、NF-κB的表達，抑制炎癥，發(fā)揮骨保護和腎保護作用[17-18]。

綜上，肉蓯蓉通過“多成分-多靶點-多途徑”治療CKD-OP，β-谷甾醇、槲皮素和紅景天苷是肉蓯蓉治療CKD-OP的雙效成分，其主要機制可能與PTGS2調(diào)控TNF 信號通路有關，該研究有待應用適宜的細胞、動物模型進行實驗論證。