于洪杰 譚國慶

1.滄州市人民醫(yī)院，河北 滄州 061000 2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院脊柱骨科，山東 濟南 250014

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是極少酒精作用下發(fā)生的超過5 %的肝細胞脂肪變性，屬代謝應激性肝損傷，已經(jīng)成為主要公眾健康問題之一[1]。其具體發(fā)病機制目前尚未明確，但普遍認為與胰島素抵抗、氧化應激和脂質(zhì)過氧化有關(guān)[2-3]。但隨著研究的不斷深入，越來越多證據(jù)表明肝臟與骨之間有著復雜聯(lián)系，NAFLD更是能夠通過多條通路影響骨骼發(fā)育成熟，臨床研究表明NAFLD患者的腰椎、髖部等部位的BMD明顯下降[4]。同時NAFLD與絕經(jīng)后女性骨密度關(guān)系更為緊密，Lee等[5]經(jīng)過回顧性橫斷面研究分析認為NAFLD是絕經(jīng)婦女骨質(zhì)疏松的高危因素。因此NAFLD與骨質(zhì)疏松(OP)之間有復雜的聯(lián)系, 且兩者之間相互影響。本研究依據(jù)生物信息相關(guān)技術(shù)方法探討非酒精性脂肪肝病與骨質(zhì)疏松之間的可能作用機制。

1 材料和方法

分別以骨質(zhì)疏松及非酒精性脂肪肝為關(guān)鍵詞在相關(guān)疾病數(shù)據(jù)庫( Disgenet、TTD、OMIM、Drugbank、Genecards)中篩選相關(guān)靶點，其中Disgenet篩選評分≥0.3 ，Genecards篩選相關(guān)度≥5。將兩組基因通過uniprot數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換成uniprot ID進行去重整合，獲得已明確的疾病靶點。然后將兩組靶點映射取得韋恩圖，將得到的關(guān)鍵靶點通過string數(shù)據(jù)庫制作靶點間相互作用PPI網(wǎng)絡。將PPI網(wǎng)絡TSV格式導進Cytoscape3.7.2，篩選節(jié)點連接度(degree)制作核心靶點圖。通過基因功能注釋DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO(Gene Ontology)生物過程富集分析以及 KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析使基因信息可視化，分別將篩選出的前20個GO條目與KEGG條目，依據(jù)Omicshare云平臺制作高級氣泡圖。

2 結(jié)果

經(jīng)過基因庫搜索、轉(zhuǎn)換ID整合后共選出與骨質(zhì)疏松癥和非酒精性脂肪肝相關(guān)基因 875 個和952個。映射出關(guān)鍵靶點217個，生成韋恩圖(見圖1)。經(jīng)string數(shù)據(jù)庫在0.7高信度下生成相互作用PPI網(wǎng)絡(見圖2)，其中有202個節(jié)點，208個靶點間具有1 280條相互作用關(guān)系。平均節(jié)點連接度(degree)為17.6，以篩選節(jié)點連接度(degree)≥36篩選到核心靶點24個(如圖3)，所獲核心靶點均直接或間接影響非酒精性脂肪肝與骨質(zhì)疏松。經(jīng)DAVID 數(shù)據(jù)庫獲得78項GO富集結(jié)果(P<0.05)及78條KEGG信號通路(P<0.05)，以P值升序排列，分別篩選出符合條件的20個生物過程和信號通路，并將其以氣泡圖的形式展現(xiàn)出來(見圖4、圖5)。通路下所含靶點分別見表1。

圖1 非酒精性脂肪肝與骨質(zhì)疏松映射關(guān)鍵靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of key targets for NAFLD and osteoporosis mapping

圖3 核心靶點圖(核心靶點大小為degree大小)Fig.3 Diagram of the core target (the size of the core target is degree size)

圖4 GO富集分析氣泡圖(前20條)Fig.4 Bubble diagram of GO enrichment analysis (first 20)

圖5 KEGG通路分析氣泡圖(前20條)Fig.5 Bubble diagram of KEGG pathway analysis (first 20)

表1 KEGG通路下所含靶基因(前20條)Table 1 Target genes contained in KEGG pathway (first 20)

3 討論

經(jīng)過相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫查重整合后發(fā)現(xiàn)NAFLD和OP均含有大量基因靶點，更說明這是兩種相對復雜的代謝性疾病，且在PPI相互作用網(wǎng)絡0.7高信度下具有1 780條相互作用關(guān)系，眾多靶基因間具有復雜的相互作用關(guān)系使兩種疾病發(fā)生密切聯(lián)系，其中白介素6(IL-6)、胰島素(INS)、 血管內(nèi)皮生長因子(VEGFA)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)、腫瘤壞死因子(TNF)等核心靶點可能是兩者相互影響的重要節(jié)點。IL-6、TNF是生物學效應廣泛的細胞炎性因子，絕經(jīng)后婦女體內(nèi)雌激素水平下降，導致雌激素抑制成骨細胞生成TNF-α能力減弱，TNF-α的增加進一步刺激成骨細胞產(chǎn)生IL-6，發(fā)揮抑制成骨、促進破骨的作用[6]。IL-6、TNF-α等促炎因子的分泌導致NAFLD容易進展成為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)[7]。有研究[8]認為NAFLD患者存在腸道菌群紊亂、致病菌增多等情況，引起體內(nèi)炎癥反應，使IL-6、TNF-α等促炎因子水平升高，誘發(fā)骨質(zhì)疏松。促炎性細胞因子是NASH病理的重要介質(zhì)，研究證實NASH患者中IL-6水平升高，且除參與炎癥作用外，IL-6、TNF-α等還通過胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝參與NASH的發(fā)生發(fā)展[9]。INS在骨質(zhì)疏松進程中具有重要作用，一方面作用于成骨細胞表面受體，上調(diào)成骨細胞活性；另一方面調(diào)節(jié)血糖水平，抑制高糖對成骨細胞的毒性作用[10]。胰島素主要調(diào)節(jié)體內(nèi)糖脂代謝，高糖除增加TNF-α、IL-6的表達外，胰島素抵抗引起代謝障礙產(chǎn)生脂肪積累，肝細胞內(nèi)過度脂肪積累通過炎癥應激等過程導致糖脂毒性，引起脂肪變性最終誘發(fā)NAFLD[11]，因此NAFLD常伴有肥胖、糖尿病等并發(fā)疾病。有研究[12]顯示缺氧對大鼠成骨細胞的骨形成能力起到抑制作用，VEGFA能夠調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的增殖和分化，增加小靜脈血管與微血管的通透性[13]，從而增加供氧，緩解缺氧狀態(tài)。同樣血管構(gòu)建也伴隨在NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程，肝竇毛細血管化是NAFLD的早期形態(tài)學變化[14]，因此通過靶向抑制肝竇脈細血管內(nèi)生成有助于延緩NAFLD發(fā)展。有關(guān)數(shù)據(jù)表明, VEGF對于肝臟內(nèi)血管形成及肝內(nèi)皮細胞增殖有調(diào)控作用[15]，因此針對性抑制VEGFA有助于促進NAFLD的良好預后。推測NAFLD臨床治療過程中可能選擇性的抑制VEGFA的表達，加重了體內(nèi)缺氧環(huán)境，導致成骨能力減弱，促進OP的發(fā)生發(fā)展。PI3K/Akt信號通路是參與骨質(zhì)疏松的經(jīng)典通路之一，TAK1是其下游重要靶激酶，在骨形成中發(fā)揮重要作用。有研究[16]發(fā)現(xiàn), 地塞米松能夠間接活化TAK1誘導成骨細胞及骨細胞的凋亡, 而TAK1抑制劑能夠抑制這種作用。AKT還是胰島素發(fā)揮生物學功能的作用底物，促進脂肪、肝臟等對葡萄糖的攝取[17]。AKT磷酸化可以有效調(diào)節(jié)糖脂代謝改善胰島素抵抗，胰島素抵抗在NAFLD進程中具有重要作用。綜上所述，骨質(zhì)疏松與非酒精信號脂肪肝具有緊密聯(lián)系，眾多核心靶點主要圍繞炎性反應及糖脂代謝等相關(guān)生理過程，這可能是二者發(fā)生聯(lián)系的相關(guān)內(nèi)在機制。

通過核心靶點富集分析可以發(fā)現(xiàn)諸多靶點通過調(diào)控多條通路發(fā)揮作用，其中主要在于乙肝通路、類風濕關(guān)節(jié)炎通路、TNF通路、IBD通路等多條信號通路。乙肝是臨床常見具有傳染性慢性肝病之一，當合并其他代謝性疾病是會增加NAFLD風險。有研究認為乙型肝炎和NAFLD具有協(xié)同作用，可加重肝臟損傷，因此預防二者協(xié)同作用具有重要意義[18]。而骨質(zhì)疏松作為乙肝的常見并發(fā)癥越來越受到重視，一項36 146例乙肝患者臨床資料總結(jié)研究發(fā)現(xiàn)，乙肝患者骨質(zhì)疏松率高于對照組1.13倍[19]，其作用機制除傳統(tǒng)核因子-κβ受體活化因子配體-核因子-κβ受體活化因子-護骨素系統(tǒng)外，還可通過鈣磷代謝、炎癥反應等影響骨質(zhì)疏松的發(fā)生[20]。類風濕性關(guān)節(jié)炎是一種自身免疫性疾病，一項隊列研究發(fā)現(xiàn)類風濕性關(guān)節(jié)炎與肝臟疾病相關(guān)，特別是非酒精性脂肪肝[21]，其作用機制可能與炎癥反應有關(guān)。這類反復炎癥也可導致全身骨量降低[22]，可能源于TNF、IL-6等細胞因子的激活，炎癥誘導骨吸收。二者可通過多種炎癥性疾病通路中靶點進行相互影響。HIF-1信號通路是VEGF表達的核心因子[23]，通過上調(diào)VEGF表達促進血管內(nèi)皮細胞增殖，發(fā)揮VEGF在骨質(zhì)疏松及NAFLD中的生理學效應。TNF、IBD、FoxO信號通路均是由炎癥反應誘導，涉及多種炎癥因子，調(diào)控骨質(zhì)疏松及NAFLD進程。FoxO信號通路還可以調(diào)控氧化應激、葡萄糖和脂質(zhì)代謝紊亂等過程[24]，這些炎癥及糖脂代謝過程均與骨質(zhì)疏松、NAFLD息息相關(guān)。有研究[25]顯示, 當FoxO1鼠肝臟FoxO1過度表達會累積游離脂肪酸，促進肝臟細胞脂肪變性。雖然目前尚缺少研究探尋通路同時對兩種疾病的影響，但不可否認上述通路從各個方面協(xié)同作用，產(chǎn)生不同生理過程來協(xié)調(diào)骨質(zhì)疏松與NAFLD關(guān)系。

本研究通過對多個數(shù)據(jù)庫進行基因信息整合，發(fā)現(xiàn)了兩組疾病復雜而龐大基因網(wǎng)絡中的交集部分，并發(fā)現(xiàn)了糖脂代謝及炎癥反應在兩種疾病間扮演的重要角色，考慮與脂肪毒性有關(guān)，但需進一步試驗驗證。