申意偉 李雪 張曉峰 徐西林* 李小冬 侯斌 呂航 李佐

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001 3.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632 4.東北師范大學(xué)生命科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130024 5.北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040

酒精性骨重構(gòu)(alcoholic bone remodeling，ABR)是以全身骨質(zhì)和骨量異常為特征，是酒精誘導(dǎo)骨組織細(xì)胞異常代謝而導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)失衡的綜合反映，破壞了成骨/破骨生理平衡，損壞了骨生物力學(xué)性能[1]，是酒精性骨壞死、酒精性骨質(zhì)疏松癥[2-3]等的共同病理過(guò)程。酒性辛熱，能通經(jīng)絡(luò)、善行藥勢(shì)；酒有癮毒，不可多服、久服，過(guò)則傷身，酗則害命[4]。酒精及其代謝物(如乙醛)對(duì)骨代謝的影響是多方面、多途徑的[5]。課題組前期從氧化應(yīng)激-自噬-成骨/成脂分化等角度探討了酒精性骨重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制[4]以及補(bǔ)腎活血類中藥(骨碎補(bǔ)、丹參、川芎等)干預(yù)酒精性骨病的潛在應(yīng)用[3,6]，并初步探究了酒精對(duì)股骨頭及股骨干生物力學(xué)性能的損害作用[1]。本研究旨在前期研究的基礎(chǔ)上系統(tǒng)探究長(zhǎng)期酒精攝入對(duì)酒精性骨重構(gòu)大鼠模型骨組織形態(tài)、骨生物力學(xué)及氧化應(yīng)激的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性 SD大鼠20只，清潔級(jí)，體質(zhì)量205～245 g，由遼寧沈陽(yáng)長(zhǎng)生科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)為SCXK(遼)2015-0001。屏障系統(tǒng)[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(黑)2016004]條件下，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，周期照明，室內(nèi)室溫 20～25 ℃，相對(duì)濕度 40%～70%，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲食和飲水。

1.1.2儀器：酶標(biāo)儀，杭州奧盛儀器有限公司(型號(hào)：AMR-100)；大小鼠電子秤，北京冀諾泰科技發(fā)展有限公司(型號(hào)：JNT-DC)；組織自動(dòng)脫水機(jī)，武漢俊杰電子有限公司(型號(hào)：JT-12 S)；石蠟包埋機(jī)，武漢俊杰電子有限公司(型號(hào)：JB-L5)；生物組織攤烤片機(jī)，武漢俊杰電子有限公司(型號(hào)：JK-6)；石蠟切片機(jī)，萊卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司(型號(hào)：RM2016)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司(型號(hào)：GFL-70)；顯微鏡，尼康儀器有限公司(型號(hào)：Eclipse Ci-L)；顯微鏡拍照系統(tǒng)，尼康儀器有限公司(型號(hào)：Nikon DS-F12)；電子萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)(Instron 5569，英斯特朗-美國(guó))；精密游標(biāo)卡尺，東莞市奧銳特精密測(cè)量科技有限公司(型號(hào)：A7)；實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)，美國(guó)Applied Bio-Systems Instruments公司(型號(hào)：ABI 7900HT)；分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司(型號(hào)：NanoDrop 2000C)。

1.1.3藥品與試劑：無(wú)水乙醇(致遠(yuǎn)化學(xué)科技有限公司，批號(hào)20171113)；切片石蠟(匯恒化工科技有限公司，批號(hào)39601095)；中性樹(shù)膠(索萊寶科技有限公司，批號(hào)20190827)；中性福爾馬林固定液(索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G2161)；改良HE染色試劑盒(索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G1121)；二甲苯(西隴科學(xué)股份有限公司，貨號(hào)：1330-20-7)；Masson三色染色試劑盒(索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G1340)；丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司，貨號(hào)：A003- 1，TBA 法)，超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司，貨號(hào)：A001-3，WST-1 法)；TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：15596018)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司，批號(hào)：A5000)；實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系試劑盒(美國(guó)Promega公司，批號(hào)：A6010)。

1.2 分組與干預(yù)

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后, 隨機(jī)分為空白組和酒精組，每組10只。酒精性骨重構(gòu)模型造模方法遵照課題組前期研究[4]。采用20%(vol/vol)酒精腹腔注射，10 mL/kg, 每日1次，共12周，復(fù)制酒精性骨損傷模型；為控制實(shí)驗(yàn)變量，正常組給予等體積生理鹽水腹腔注射。

1.3 樣本采集及處理

大鼠稱重后禁食 12 h，麻醉后心臟取血，3 000 r/min、4 ℃離心15 min 后分離血清，分裝血清200 μL/管，-80 ℃恒溫冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ坞x取股骨、脛骨和第五椎體，剔除附著軟組織，根據(jù)不同檢測(cè)指標(biāo)給予相應(yīng)處置、備用。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1HE染色：取動(dòng)物新鮮組織塊投入固定液中使組織、細(xì)胞的蛋白質(zhì)變性凝固；用由低濃度到高濃度酒精作脫水劑，逐漸脫去組織塊中的水份；將已透明的組織塊置于已熔化的石蠟中，放入熔蠟箱保溫，待石蠟完全浸入組織塊后進(jìn)行包埋；將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上，切成薄片，一般為5～8 μm厚，貼到載玻片上，放45 ℃恒溫箱中烘干；用二甲苯脫去切片中的石蠟，再經(jīng)由高濃度到低濃度酒精，最后入蒸餾水；放入蘇木精-伊紅染色液染色數(shù)分鐘；繼之經(jīng)純酒精脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明，封片。

1.4.2Masson染色：骨石蠟切片脫蠟至水，依次自來(lái)水和蒸餾水洗，用蘇木精染液染核5～10 min，充分水洗，如過(guò)染可鹽酸酒精分化，蒸餾水洗，Masson麗春紅酸性復(fù)紅液5～10 min，以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min，不經(jīng)水洗，直接用苯胺藍(lán)或光綠液染5 min，以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，95%酒精、無(wú)水酒精、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封固。

1.4.3micro-CT掃描：獲取大鼠股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端和腰椎進(jìn)行Micro-CT分析。剔除骨周軟組織，將其在10 %福爾馬林中固定過(guò)夜，然后使用高分辨率Micro-CT(瑞士SCANCO，μCT50)進(jìn)行了掃描分析。球管電壓：70 kV；球管電流：預(yù)覽60 μA，掃描200 μA，Voxel size：10.3 μm，slice increment：10.3 μm。生長(zhǎng)板以下3 mm厚度為VOI(volume of interest)，構(gòu)建橫截面圖像，以對(duì)小梁骨進(jìn)行三維組織形態(tài)分析。

1.4.4生物力學(xué)測(cè)試：將股骨、脛骨和椎體標(biāo)本放于室溫緩慢解凍。測(cè)試過(guò)程中避免樣本干燥注意保持濕度。股骨和脛骨放置在力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)支架上行三點(diǎn)彎曲測(cè)試，支座跨距2 cm，壓頭直徑為1.5 mm，穩(wěn)定樣本擺位使兩支點(diǎn)中心與樣本加載點(diǎn)重合，勻速加載至標(biāo)本斷裂，描記出載荷-位移曲線。椎體放置在力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)支架上行壓縮測(cè)試，靠近尾端椎骨面朝下放立，勻速加載至標(biāo)本破裂，描記出載荷-位移曲線。測(cè)試環(huán)境溫度23～25 ℃，力學(xué)試驗(yàn)機(jī)載荷測(cè)量精度0.001 N，位移(撓度) 測(cè)量精度0.001 mm，加載速度1 mm/min，選用1 000 N以內(nèi)的小載荷量程，用游標(biāo)卡尺測(cè)量骨面長(zhǎng)短軸及斷面內(nèi)外徑和壁厚，儀器自載軟件記錄并分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.4.5骨髓提取及其骨穩(wěn)態(tài)標(biāo)志物檢測(cè)：完整游離股骨并剔除周圍肌肉、肌腱和骨膜等軟組織，去除兩端骨骺開(kāi)放骨髓腔，使用25號(hào)針頭用alpha-MEM將骨髓沖洗出髓腔。將沖洗過(guò)骨髓腔的股骨外表面用無(wú)菌紗布反復(fù)摩擦幾次，然后用蛋白酶溶液(含2 mg/mL膠原酶A和2.5 mg/mL胰蛋白酶的PBS溶液)室溫消化20～30 min，以除去骨膜和骨膜祖細(xì)胞。繼之，將股骨切成兩斷，然后在蛋白酶溶液中消化1～1.5 h，離心收集上清液中細(xì)胞。TRIzol試劑提取樣品總RNA，使用高效cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。qRT-PCR在ABI 7900實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行。在前期研究基礎(chǔ)上，遴選表征骨髓成骨/破骨功能關(guān)鍵標(biāo)志物，檢測(cè)如下指標(biāo)：I型膠原蛋白Alpha 2鏈(COL1A2，上游5′-AAGAATGC ATACAGCCGTGC-3′，下游5′-ACTGCTCT GACCAATCCTTC-3′)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2，上游5′-TGCGGTCTCCTAAAGGTCG-3′，下游5′-GGACTTAAGACGCTTCCGCT-3′)、NF-κβ配體的受體激活劑(RANKL，上游5′-TGATGGAA GGTTCGTGGCTC-3′，下游5′-GGTACGCTCCC TGAGGTTTC-3′)和骨保護(hù)素(OPG，上游5′-GGCACACGAGTGATGAATGC-3′，下游5′-TCTTC GCACAGGGTGACATC-3′)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，上游5′-GTGAAGGTCGGTGTGAACGG-3′，下游5′-CCCCATTTGATGTTAGCGGG-3′)基因的表達(dá)水平作為參考。并使用2-ΔΔCT方法計(jì)算mRNA表達(dá)的相對(duì)定量。

1.4.6血清MDA、SOD及SOD/MDA水平測(cè)定：冰上融化血清樣品觀察血清是否渾濁，如有渾濁需要3 500 r/min、4 ℃離心15 min，取上清待用。TBA法檢測(cè)血清丙二醛(MDA)含量，WST-1法檢測(cè)血清超氧化物歧化酶(SOD)含量。測(cè)定方法詳見(jiàn)MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司，貨號(hào)：A003-1)，SOD測(cè)定試劑盒 (南京建成生物工程研究所有限公司，貨號(hào)：A001-3)。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：圖中黑箭頭所示為骨小梁，左下角標(biāo)尺所示為500 μm。圖1 空白組和酒精組骨組織HE染色Fig.1 HE staining results in the blank group and alcohol group

HE染色可見(jiàn)，空白組骨樣本骨小梁粗大、排列整齊、連續(xù)性好，呈現(xiàn)網(wǎng)狀分布；而酒精組骨小梁的連接中斷點(diǎn)明顯增多，骨小梁較細(xì)、骨小梁分布較稀疏，甚者可見(jiàn)無(wú)骨小梁骨髓區(qū)。

2.2 Masson染色結(jié)果

Masson染色結(jié)果見(jiàn)圖2。

Masson染色可見(jiàn)，皮質(zhì)骨及松質(zhì)骨所含膠原纖維及軟骨區(qū)呈藍(lán)色，骨組織胞漿及骨周肌纖維呈紅色，胞核呈藍(lán)黑色?？瞻捉M骨樣本所含膠原纖維染色呈深藍(lán)色、膠原纖維排列整齊、連續(xù)性好，呈現(xiàn)網(wǎng)狀分布；而酒精組骨樣本膠原纖維染色呈淡淺藍(lán)色，膠原纖維連接中斷點(diǎn)明顯增多，膠原纖維分布較稀疏，甚者可見(jiàn)無(wú)膠原纖維骨髓區(qū)。

2.3 Micro-CT分析

Micro-CT分析見(jiàn)圖3和表1。

注：圖中黑箭頭所示為骨小梁區(qū)，左下角標(biāo)尺所示為500 μm。圖2 空白組和酒精組骨組織Masson染色Fig.2 Masson staining results in the blank group and alcohol group

圖3 空白組和酒精組骨組織micro-CT分析Fig.3 Mico-CT analysis in the blank group and alcohol group

表1 空白組和酒精組骨組織結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1 Bone morphology indexes in the blank group and alcohol

和空白組比較，酒精組骨小梁數(shù)量 (trabecular number，Tb.N，1/mm)和骨小梁厚度 (trabecular thickness，Tb.Th，mm)均顯著降低，骨小梁間距 (trabecular space, Tb.Sp，mm) 顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 骨生物力學(xué)測(cè)試

圖4描繪了骨骼樣本測(cè)試時(shí)所記錄的載荷(N)-位移(mm)曲線，骨骼主要是由有機(jī)質(zhì)(膠原蛋白等)和無(wú)機(jī)質(zhì)(鈣、磷、水、礦物質(zhì)等)組成的兩相多孔性復(fù)合材料，二者相輔相成共同維系骨機(jī)械性能。為進(jìn)一步可視化酒精對(duì)股骨、脛骨和椎體構(gòu)的影響，明確骨力學(xué)性能參數(shù)變化，本研究采用數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化、無(wú)量綱化以系統(tǒng)聚類熱圖展示如下，其中，行為骨生物力學(xué)參數(shù)(彈性載荷、彈性模量、最大應(yīng)力、最大應(yīng)變、彈性應(yīng)力)，列為來(lái)自空白組和酒精組的骨骼樣本(綠色為酒精組，粉紅色為空白組)。熱圖中單元格顏色表示所測(cè)骨生物力學(xué)參數(shù)大小，深藍(lán)色至深紅色表示取值在0至1之間變化(數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理)；股骨、脛骨和椎體熱圖右側(cè)分別標(biāo)注了兩組間彈性載荷、彈性模量、最大應(yīng)力、最大應(yīng)變和彈性應(yīng)力統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，其中“*”表示組間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.05)，“-” 表示組間差異不具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；熱圖上樹(shù)狀圖為系統(tǒng)聚類結(jié)果。

注：載荷-位移曲線圖中A為屈服點(diǎn)，B為最大載荷點(diǎn)，C為破壞點(diǎn)，O-D為彈性形變，D-E為塑性形變。圖4 空白組和酒精組骨組織載荷-位移曲線Fig.4 Bone loading-shifting curve in the blank group and alcohol group

圖5 空白組和酒精組骨生物力學(xué)參數(shù)熱圖可視化Fig.5 Chart of bone biomechanics indexes in the blank group and alcohol group

圖5中行為骨生物力學(xué)參數(shù)，列為來(lái)自空白組和酒精組的骨骼樣本，單元格顏色表示所測(cè)骨生物力學(xué)參數(shù)大小，深藍(lán)色至深紅色表示取值在0至1之間變化；熱圖右側(cè)分別標(biāo)注了兩組間統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，其中“*”表示P< 0.05，“-” 表示P>0.05；熱圖上方樹(shù)狀圖為系統(tǒng)聚類結(jié)果。

由圖5可知，與空白組比較，酒精組彈性載荷、彈性模量、最大應(yīng)力和彈性應(yīng)力均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；最大應(yīng)變未見(jiàn)顯著變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示長(zhǎng)期酒精攝入可損害骨(股骨、脛骨和椎體骨)生物力學(xué)性能，綜合HE染色、Masson染色和Micro-CT分析結(jié)果，酒精可能通過(guò)介導(dǎo)骨微觀結(jié)構(gòu)紊亂(骨小梁分布紊亂及骨膠原纖維減少等)，繼而導(dǎo)致骨生物力學(xué)性能異常，最終導(dǎo)致或加重了酒精性骨重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展。

2.5 酒精對(duì)骨髓骨穩(wěn)態(tài)標(biāo)志物mRNA的影響

酒精對(duì)骨髓骨穩(wěn)態(tài)標(biāo)志物mRNA的影響見(jiàn)表2。

結(jié)果表明，與空白組比較，酒精組骨形成相關(guān)基因BMP2和COL1A2 mRNA表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示長(zhǎng)期酒精攝入對(duì)骨形成有顯著抑制作用；破骨活化相關(guān)基因RANKL表達(dá)顯著增加，而骨保護(hù)素OPG mRNA 表達(dá)顯著降低。

表2 各組骨穩(wěn)態(tài)標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平情況

2.6 酒精對(duì)血清MDA、SOD及SOD/MDA水平的影響

酒精對(duì)血清MDA、SOD及SOD/MDA水平的影響見(jiàn)表3。

表3 各組血清MDA、SOD及SOD/MDA水平情況

與空白組比較，酒精組血清丙二醛MDA(脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo))含量顯著增加，而超氧化物歧化酶SOD(抗氧化指標(biāo))減少，SOD/MDA顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

酒精和乙醛(一種內(nèi)源性和酒精衍生代謝產(chǎn)物)會(huì)破壞染色體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致干細(xì)胞基因組突變[7]，如DNA單鏈和/或雙鏈斷裂、姐妹染色單體交換、基因點(diǎn)突變和DNA間交聯(lián)等；在15～49歲人群中，女性死亡率約3.8%和男性死亡率約12.2 %可歸因于酒精使用[8]。本研究表明，長(zhǎng)期酒精攝入可破壞生理性骨重構(gòu)，導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)失衡、骨小梁及纖維蛋白分布紊亂等(圖1、2和3)；酒精性骨重構(gòu)是酒精誘導(dǎo)骨組織細(xì)胞異常代謝而導(dǎo)致成骨/破骨失衡的綜合反映，本研究中，長(zhǎng)期酒精攝入破壞了機(jī)體氧化還原平衡，導(dǎo)致機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)(表3)；酒精同時(shí)破壞骨髓成骨/破骨穩(wěn)態(tài)，抑制成骨而促進(jìn)破骨活動(dòng)(表2)，終致骨質(zhì)和骨生物力學(xué)性能異常，增加了罹患骨折、骨質(zhì)疏松和骨壞死等骨病風(fēng)險(xiǎn)。

本研究表明，酒精可抑制COL1A2基因表達(dá)減少了骨骼中膠原纖維蛋白的合成(表2)，使骨基質(zhì)纖維蛋白減少及分布異常(圖2)，這些變化可能是酒精性骨重構(gòu)發(fā)生時(shí)骨生物力學(xué)性能(彈性載荷、彈性模量、最大應(yīng)力和彈性應(yīng)力)破壞的原因之一，膠原纖維蛋白含量、分布及交聯(lián)狀態(tài)在酒精性骨重構(gòu)發(fā)生發(fā)展的作用仍有待進(jìn)一步研究[4]。盡管膠原纖維蛋白對(duì)骨骼強(qiáng)度和剛度的影響遠(yuǎn)不如無(wú)機(jī)質(zhì)含量顯著，但其對(duì)骨質(zhì)脆性的影響卻十分顯著[9]。本研究，酒精組骨彈性載荷、彈性模量、最大應(yīng)力和彈性應(yīng)力均顯著降低，提示長(zhǎng)期酒精攝入損害了骨(股骨、脛骨和椎體骨)生物力學(xué)性能，綜合HE、Masson染色和Micro-CT分析結(jié)果，酒精可能通過(guò)介導(dǎo)骨微觀結(jié)構(gòu)紊亂(骨小梁分布紊亂及骨膠原纖維減少等)，繼而導(dǎo)致骨生物力學(xué)性能異常，最終導(dǎo)致或加重了酒精性骨重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展。酒精性骨重構(gòu)表現(xiàn)為成骨/破骨生理平衡被破壞、微觀結(jié)構(gòu)異常和力學(xué)性能改變，可歸咎于酒精及其代謝物直接或間接作用，酒精對(duì)機(jī)體激素水平、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、骨細(xì)胞以及骨髓微環(huán)境、腸道微環(huán)境等結(jié)構(gòu)與功能的影響，值得深入研究，勢(shì)必有助于尋找到干預(yù)酒精性骨重構(gòu)最佳潛在治療靶點(diǎn)。酒精可能同時(shí)對(duì)成骨、破骨、膠原纖維蛋白和骨髓微環(huán)境等產(chǎn)生影響，酒精作用的多樣性已被本研究證實(shí)(圖1～3、表2和3)，本研究明確了酒精對(duì)骨骼重構(gòu)的影響是多方面、多途徑、多維度的。骨骼由有機(jī)質(zhì)和無(wú)機(jī)質(zhì)構(gòu)成的非勻質(zhì)復(fù)合材料，礦物質(zhì)化的骨基質(zhì)、骨骼細(xì)胞、造血細(xì)胞、骨髓脂肪細(xì)胞和間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞對(duì)骨材料力學(xué)性能產(chǎn)生重要影響。骨骼結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和動(dòng)態(tài)性大大地增加了解析上述因素參與酒精性骨重構(gòu)力學(xué)性能異常的難度?，F(xiàn)已明確的是，骨小梁減少、結(jié)構(gòu)紊亂及分布異常(圖1和3)、骨膠原纖維含量減少及分布紊亂(圖2)、成骨抑制伴破骨亢進(jìn)(表2)和機(jī)體氧化還原失衡(表3)均在酒精性骨重構(gòu)發(fā)生發(fā)展中起重要作用，最終導(dǎo)致了骨結(jié)構(gòu)和骨力學(xué)性能異常。骨髓微環(huán)境在骨骼重構(gòu)、骨穩(wěn)態(tài)、骨發(fā)育、骨再生和骨修復(fù)中的作用越發(fā)備受關(guān)注[10-12]。骨髓在解剖結(jié)構(gòu)上與造血和骨組織緊密接觸，課題組前期初步探究了骨髓脂質(zhì)代謝與機(jī)體代謝、腸道菌群及骨穩(wěn)態(tài)的潛在關(guān)系[13-14]，鑒于骨髓結(jié)構(gòu)復(fù)雜性及功能多樣性，骨髓在酒精性骨重構(gòu)中的確切機(jī)制有待深入探究。本研究采用酶解方法提取骨髓物，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)以探究酒精對(duì)骨髓微環(huán)境成骨/破骨潛在功能的影響(表2)，結(jié)果表明，酒精組骨形成標(biāo)志基因BMP2和COL1A2 mRNA表達(dá)顯著降低，提示長(zhǎng)期酒精攝入顯著抑制骨形成；破骨相關(guān)基因RANKL表達(dá)顯著增加，而骨保護(hù)素OPG mRNA表達(dá)顯著降低，提示長(zhǎng)期酒精攝入可激活破骨水平，酒精性骨重構(gòu)可表現(xiàn)為骨形成減少和骨吸收增加的骨穩(wěn)態(tài)失衡。本研究提示，調(diào)控骨髓微環(huán)境成骨/破骨功能，增加成骨活性、抑制破骨功能可作為干預(yù)酒精性骨重構(gòu)的治療靶標(biāo)。

綜上，酒精對(duì)骨重構(gòu)的影響是多方面、多途徑、多維態(tài)的，酒精可導(dǎo)致骨小梁及膠原纖維蛋白數(shù)量和分布異常、骨生物力學(xué)性能降低、骨髓成骨/破骨功能失衡，成骨被抑制而破骨被激活，同時(shí)破壞了機(jī)體氧化還原平衡，導(dǎo)致機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，酒精攝入破壞了大鼠骨穩(wěn)態(tài)，終致骨質(zhì)、骨量和骨力學(xué)性能異常，增加了罹患骨折、骨量丟失、骨質(zhì)疏松和骨壞死等骨病風(fēng)險(xiǎn)。本研究為臨床防治酒精性骨病提供了參考和依據(jù)。