王嬌，張杰，趙佳，趙茂吉，明春艷，張兵*

地中海貧血(簡(jiǎn)稱地貧)又稱為海洋性貧血，是一種因珠蛋白基因突變或缺失引起珠蛋白肽鏈合成異常導(dǎo)致的慢性進(jìn)行性溶血性貧血[1-3]。地貧是一種常見的單基因隱性遺傳疾病，以α和β地貧最多見[4-5]。在我國，截止目前為止，超過3 000萬人攜帶地貧基因，主要分布在海南、廣西、廣東及周邊省份，比如福建、湖南、貴州、四川、云南等地區(qū)[6]。其中重型地貧是一種非常嚴(yán)重的致死性血紅蛋白病，目前尚無有效的根治方法，但可通過對(duì)育齡夫婦進(jìn)行產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷以防止缺陷患兒出生，從而達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育的目的[7-8]。為此，本研究對(duì)2018年1月至2020年12月在南充市中心醫(yī)院進(jìn)行產(chǎn)檢、不孕檢查及孕前檢查且疑似地貧的3 075例育齡夫婦地貧基因突變類型及分布特點(diǎn)進(jìn)行了調(diào)查分析，為本地區(qū)優(yōu)生優(yōu)育提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2020年12月在南充市中心醫(yī)院就診的疑似地貧的育齡夫婦3 075例，年齡16～48歲，平均(27.64±7.28)歲，且每對(duì)夫婦任意一方的平均紅細(xì)胞體積(mean corpuscular volume,MCV)小于80 fL，平均紅細(xì)胞血紅蛋白量(mean corpuscular hemoglobin,MCH)小于27 pg[1]。所有受檢者均簽署知情同意書，并通過倫理委員會(huì)審查。

1.2 主要儀器與試劑

BC-6900全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及配套試劑由深圳邁瑞生物科技公司提供；SLAN-96P型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀由上海宏石有限公司提供；DNA提取配套試劑盒和α、β地貧基因檢測(cè)試劑盒由廣東凱普生物科技股份有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 血常規(guī)檢測(cè) 采用邁瑞B(yǎng)C-6900全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測(cè)，所有操作均嚴(yán)格按照儀器和試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 DNA分離提取 采用凱普血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型),嚴(yán)格按照說明書提取DNA樣本。

1.3.3 地貧基因檢測(cè) 采用Gap-PCR技術(shù)和反向斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)人抗凝靜脈血樣本中3種缺失型α-地貧(--SEA、-α3.7和-α4.2)、3種突變型α-地貧(CS、QS、WS)及17種點(diǎn)突變型β-地貧(CD41-42、CD43、IVS-II-654、CD17、CD14-15、-28、-29、CD71-72、βE、IVS-I-1、CD27-28、IVS-I-5、CAP、Int、CD31、-30、-32)。操作過程參照凱普地貧基因檢測(cè)試劑說明書進(jìn)行，室內(nèi)質(zhì)控由試劑盒內(nèi)提供，其中陰性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果條膜上無藍(lán)紫色斑點(diǎn)出現(xiàn)，正常對(duì)照探針處出現(xiàn)藍(lán)紫色斑點(diǎn)，如圖1所示。室間質(zhì)評(píng)由國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心提供，具體操作步驟同樣本處理。

A：陰性對(duì)照；B：正常對(duì)照

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 育齡夫婦地貧基因分布情況

3 075例受檢者中檢測(cè)出地貧基因陽性樣本647例，陽性檢出率達(dá)21.04%。其中 α-地貧基因陽性樣本、β-地貧基因陽性樣本、αβ復(fù)合型地貧基因陽性占總陽性樣本的數(shù)據(jù)詳見下頁表1。

表1 3 075例樣本地貧基因分布情況(%)

2.2 3 075例育齡夫婦地貧基因突變類型及構(gòu)成比

經(jīng)地貧基因檢測(cè)結(jié)果顯示，3 075例樣本中，包括α-地貧319例，以--SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα基因型為主，詳見表2；β-地貧315例，以CD17(A→T)、CD41-42(-TCTT)、IVS-II-654(C→T)基因型為主，詳見表3；αβ復(fù)合型地貧13例，以--SEA/αα復(fù)合CD41-42為主，詳見表4。

表2 α-地貧基因突變類型及構(gòu)成比

表3 β-地貧基因突變類型及構(gòu)成比

2.3 非地貧基因攜帶組與地貧組紅細(xì)胞參數(shù)比較

與非地貧基因攜帶組比較，地貧組患者RBC 明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=73.421，P<0.01)；Hb、MCV、MCH 及 MCHC 明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-24.68，-97.74，-96.58，-37.14，P<0.01)。詳見表5。

表4 αβ復(fù)合型地貧基因突變類型及構(gòu)成比

3 討論

地貧是全球分布最廣、累及人群最多的一種單基因隱性遺傳病。在我國南方各地方報(bào)道的地貧檢出率為2.50%～20.00%[9]。由于地貧具有顯著的遺傳差異，在不同種族、不同地域具有不同的分布特點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)南充地區(qū)3 075例疑診患者檢出地貧基因攜帶者647例，檢出率為21.04%，檢出率高于遂寧、自貢等四川地區(qū)[10-11]。α-地貧與β-地貧基因陽性樣本的比值為1.01∶1，高于自貢(0.57∶1)、遂寧(0.58∶1)、瀘州(0.65∶1)，與德陽一致[10-13]。表明南充地區(qū)地貧陽性檢出例數(shù)較多，α-地貧與β-地貧攜帶率相近，分布具有區(qū)域性特點(diǎn)。

α-地貧依據(jù)α珠蛋白基因缺失的數(shù)量在臨床表型中可分為靜止型(-α/αα)、標(biāo)準(zhǔn)型(--/αα)、中間型(--/-α)和重型(--/--，即 Hb Bart 胎兒水腫綜合征)[14]。靜止型和輕型地貧臨床癥狀不明顯，中重型地貧患者則需要依賴輸血治療，給家庭及社會(huì)帶來極大負(fù)擔(dān)。重型α-地貧的胎兒在孕晚期容易發(fā)生嚴(yán)重的水腫，或出生后數(shù)小時(shí)死亡。目前尚無有效的治療措施，但可通過遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷避免重型α-地貧的胎兒出生。本研究通過基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)12種α-地貧基因型，以--SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα基因型為主，分別占α-地貧的51.10%、28.52%、6.90%，這與國內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果一致[15-16]，表明南充地區(qū)與我國其他地區(qū)一樣，主要以東南亞缺失型(--SEA/αα)為α-地貧最常見的基因類型。

表5 地貧組與非地貧基因攜帶組紅細(xì)胞各參數(shù)的比較

β-地貧是由于β珠蛋白基因出現(xiàn)突變，導(dǎo)致β珠蛋白鏈合成減少，血紅蛋白A顯著減少甚至沒有。在我國，β-地貧主要以CD17 (A>T)、CD41/42(-TCTT)、IVS-2-654(C>T)、-28(A>G)、CD71/72(+A)5種突變類型最常見,約占所有類型的90%[17]。本研究結(jié)果顯示，在3 075例育齡夫婦中，共檢測(cè)出315例β-地貧陽性患者，主要以CD17(A→T)、CD41-42(-TCTT)、IVS-II-654(C→T)基因型為主，分別占β-地貧的38.10%、32.38%、18.10%，這與自貢、瀘州等地研究結(jié)果相同[11-12]，以CD17突變型為主，而與德陽地區(qū)以CD41-42突變型為主略有差異[13]。表明南充地區(qū)β-地貧基因型與四川其他地區(qū)基本一致,但稍有差異，可能與南充地區(qū)獨(dú)特的地理環(huán)境和地區(qū)間人口相互遷徙交流有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)αβ復(fù)合型地貧13例，涉及7種基因突變類型，以--SEA/αα復(fù)合CD41-42為主。有文獻(xiàn)報(bào)道，αβ復(fù)合型地貧患者無論與何種地貧患者進(jìn)行婚配，均可能生出中間型或重型地貧患兒，如果雙方均為αβ復(fù)合型地貧患者,生出重型患兒的概率將會(huì)極大地提升[18]。因此對(duì)αβ復(fù)合型地貧的準(zhǔn)確診斷，能夠降低中間型及重型地貧患兒的發(fā)生率，有助于提高人口質(zhì)量。

此外，根據(jù)基因檢測(cè)結(jié)果，本研究把所有基因檢測(cè)患者分為非地貧基因攜帶組及地貧組，對(duì)其紅細(xì)胞參數(shù)進(jìn)行了詳細(xì)地分析。研究結(jié)果顯示，與非地貧基因攜帶組紅細(xì)胞參數(shù)比較，地貧組RBC明顯升高，Hb、MCV、MCH、MCHC明顯降低。其中MCV為(71.98±7.54)fL，比納入標(biāo)準(zhǔn)MCV 80 fL要低很多，這與沙琨[19]研究一致。雖然MCV、MCH在診斷地貧方面有一定的作用，但仍需多個(gè)參數(shù)綜合考慮，才能為臨床診斷地貧提供更加準(zhǔn)確的參考依據(jù)[20]。

與杜利君等[21]對(duì)南充地區(qū)人群的地貧相關(guān)研究相比，本研究具有以下特點(diǎn)：① 納入對(duì)象僅限育齡夫婦患者，而杜利君等的研究納入對(duì)象為所有地貧陽性初篩患者，包括老年人和兒童；② 納入標(biāo)準(zhǔn)為育齡夫婦任意一方的MCV 小于80 fL，MCH小于27 pg，極大地降低了地貧漏檢的概率；③ 納入的地貧樣本量更大，分析更加全面；④ 研究發(fā)現(xiàn)的α-地貧、β-地貧和αβ復(fù)合型地貧基因類型顯著增多；⑤ 共檢出αβ復(fù)合型地貧13例，且以--SEA/αα復(fù)合CD41-42為主，杜利君等[21]的研究尚未對(duì)復(fù)合型地貧進(jìn)行系統(tǒng)分析；⑥ 本研究還分析了非地貧基因攜帶患者和地貧患者紅細(xì)胞參數(shù)的關(guān)系，可為本地區(qū)地貧的診斷提供理論依據(jù)。所以，本研究相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)更能真實(shí)地反映南充地區(qū)育齡人群中的地貧患者分子遺傳學(xué)背景。

綜上所述，南充地區(qū)地貧基因陽性檢出例數(shù)較多且地貧基因類型復(fù)雜多樣，其中α-地貧以--SEA/αα缺失最常見，β-地貧以CD17突變最常見，兩種地貧的攜帶率相似，分布具有區(qū)域性特點(diǎn)。因此，應(yīng)該加強(qiáng)本地區(qū)育齡夫婦地貧產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷，從而減少重癥地貧患兒的出生，達(dá)到減少本地區(qū)出生缺陷的目的。