謝程，李文亞*，彭莉

子癇前期作為妊娠期特發(fā)疾病，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為妊娠20周以后開始出現(xiàn)的高血壓，易引發(fā)各種母嬰不良結(jié)局[1]。因此，尋找相關(guān)基因修飾靶點，從而采取針對性措施，可能是改善圍生兒不良預(yù)后的有效措施。目前研究表明，胎兒臍動脈血流參數(shù)檢測可有效預(yù)測圍生兒預(yù)后情況[2]。血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)又稱為熱休克蛋白32(heat shock protein 32，HSP32)，是目前已知的最易受誘導(dǎo)型基因，在胎盤絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞、胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有分布[3]。核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是影響細(xì)胞正常生長發(fā)育的應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子，主要存在于細(xì)胞胞漿內(nèi)[4]。林培紅等[5]研究表明，NF-κB和HSP70可能參與子癇前期的發(fā)生發(fā)展。本研究主要探討子癇前期孕婦胎盤中HO-1、NF-κB表達(dá)水平與胎兒臍動脈血流的關(guān)系，以期為改善圍生兒不良結(jié)局提供新的基因修飾靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019年7月至2020年12月于長江大學(xué)附屬仙桃市第一人民醫(yī)院住院分娩的152例子癇前期孕婦，根據(jù)病情程度將其分為輕度組74例和重度組78例，同期選取79例正常妊娠孕婦作為正常妊娠組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：① 子癇前期孕婦符合第九版《婦產(chǎn)科學(xué)》[6]診斷標(biāo)準(zhǔn)及分度標(biāo)準(zhǔn)；② 孕婦分娩方式為剖宮產(chǎn)；③ 病歷資料齊全者；④ 孕婦妊娠期間無其它妊娠內(nèi)科合并癥；⑤ 均為單胎頭位妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 孕婦近1個月內(nèi)有手術(shù)外傷史；② 孕婦妊娠期間存在飲酒及吸煙史；③ 已參與其他臨床試驗或因其它原因中途退出者；④ 孕婦有結(jié)核、肝炎或其他傳染病史。

本研究經(jīng)本院臨床研究倫理委員會批準(zhǔn)，且符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，所有受試者及家屬均自愿參加，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒(貨號：R1200-100)購自北京索萊寶科技有限公司；qPCR SYBR?Green Mix(貨號：11203ES03)購自上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：KL266)購自上海康朗生物科技有限公司。qRT-PCR儀(型號：CFX384)購自美國Bio-Rad公司；彩色多普勒超聲診斷儀(型號：Voluson-E8)購自美國GE公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存 采集新鮮胎盤，無菌操作取胎盤滋養(yǎng)層組織1 cm×1 cm×1cm(臍帶附著處至胎盤另一面中央?yún)^(qū)1/2處)，放入經(jīng)焦炭酸二乙酯處理的冷凍管中保存待測；同時采集孕婦產(chǎn)前外周靜脈血，離心收集血清，-80℃保存待測。

1.3.2 一般資料收集 收集整理受試者一般資料，主要包括孕婦年齡、孕前BMI、孕中期BMI增加、入院孕周、孕次、產(chǎn)次、收縮壓、舒張壓。同時統(tǒng)計圍生兒預(yù)后情況，主要包括早產(chǎn)、低出生體質(zhì)量、圍生兒死亡、胎兒宮內(nèi)窘迫、新生兒窒息。

1.3.3 胎盤中HO-1 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)水平測定 采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測胎盤及產(chǎn)前血清中HO-1 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)水平。采用試劑盒提取胎盤總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR儀對HO-1、NF-κB及其內(nèi)參(GAPDH)進(jìn)行擴(kuò)增，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。qRT-PCR反應(yīng)體系：cDNA(50 ng/μL)2 μL，上下游引物(10 μM)各0.8 μL，qPCR SYBR?Green Mix 10 μL，ddH2O 6.4 μL。每份樣品均設(shè)3個重復(fù)孔，采用2-ΔΔCT法計算胎盤及產(chǎn)前血清中HO-1 mRNA、NF-κB mRNA相對表達(dá)量。

1.3.4 胎兒臍動脈血流參數(shù)檢測 采用彩色多普勒超聲診斷儀檢測胎兒臍動脈血流參數(shù)。探頭頻率3.5 MHz，受試者取仰臥位，呼吸平靜，常規(guī)檢查羊水指數(shù)、胎盤、胎兒各項發(fā)育指標(biāo)，于胎兒安靜時檢測臍動脈，取樣點選取臍帶距胎盤附著點2 cm處，臍動脈與取樣點夾角小于15°，頻譜縱軸顯示血流方向及流速，橫軸表示時間，獲取5個連續(xù)且清晰的多普勒頻譜后凍結(jié)圖像，通過儀器自帶的軟件測量計算臍動脈搏動指數(shù)(pulsation index，PI)、阻力指數(shù)(resistance index，RI)、收縮末期最大流速與舒張末期最大流速比值(maximum end-systolic flow rate and end-diastale the maximum flow rate ratio,S/D)。當(dāng)PI≥1.5、RI≥0.8、S/D≥3時判定為臍動脈血流動力學(xué)異常，根據(jù)胎兒臍動脈血流動力學(xué)是否異常將子癇前期孕婦分為血流動力學(xué)正常組103例和血流動力學(xué)異常組49例。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 正常妊娠組、輕度組、重度組一般資料比較

正常妊娠組、輕度組、重度組年齡、孕前BMI、孕中期BMI增加、入院孕周、孕次、產(chǎn)次比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；重度組收縮壓、舒張壓高于輕度組和正常妊娠組，輕度組收縮壓、舒張壓高于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

2.2 正常妊娠組、輕度組、重度組胎盤中HO-1 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較

重度組胎盤中NF-κB mRNA水平高于輕度組和正常妊娠組，HO-1 mRNA水平低于輕度組和正常妊娠組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；輕度組胎盤中NF-κB mRNA水平高于正常妊娠組，HO-1 mRNA水平低于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見下頁表3。

2.3 正常妊娠組、輕度組、重度組胎兒臍動脈血流參數(shù)比較

重度組PI、RI、S/D水平高于輕度組和正常妊娠組，輕度組PI、RI、S/D水平高于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見下頁表4。

表1 qRT-PCR引物序列

表2 正常妊娠組、輕度組、重度組一般資料比較

表3 正常妊娠組、輕度組、重度組胎盤中HO-1 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較

表4 正常妊娠組、輕度組、重度組胎兒臍動脈血流參數(shù)比較

2.4 子癇前期孕婦胎盤中HO-1 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)水平與胎兒臍動脈血流參數(shù)的相關(guān)性

Pearson法分析結(jié)果顯示，子癇前期孕婦胎盤中HO-1 mRNA表達(dá)水平與NF-κB mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.672，P<0.05)，且HO-1 mRNA表達(dá)水平與PI、RI、S/D均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，NF-κB mRNA表達(dá)水平與PI、RI、S/D均呈正相關(guān)(P<0.05)。詳見圖1、表5。

圖1 子癇前期孕婦胎盤中HO-1 mRNA表達(dá)水平與NF-κB mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性

表5 子癇前期孕婦胎盤中HO-1 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)水平與胎兒臍動脈血流參數(shù)的相關(guān)性

2.5 子癇前期孕婦中血流動力學(xué)正常組和血流動力學(xué)異常組圍生兒預(yù)后情況比較

子癇前期孕婦中血流動力學(xué)異常組不良妊娠結(jié)局總發(fā)生率高于血流動力學(xué)正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表6。

2.6 子癇前期孕婦中不同圍生兒預(yù)后組產(chǎn)前血清HO-1 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較

根據(jù)圍生兒預(yù)后情況將子癇前期孕婦分為預(yù)后良好組102例和預(yù)后不良組50例，預(yù)后不良組產(chǎn)前血清NF-κB mRNA水平高于預(yù)后良好組，HO-1 mRNA水平低于預(yù)后良好組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見下頁表7。

3 討論

子癇前期的發(fā)病機(jī)制目前主要有炎癥學(xué)說、免疫失衡學(xué)說、血管內(nèi)皮受損學(xué)說、胎盤缺血缺氧及氧化應(yīng)激學(xué)說、遺傳學(xué)說等[7]。有研究推測子癇前期胎盤局部缺血，導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入不足而發(fā)生免疫失衡，而免疫失衡又進(jìn)一步引發(fā)氧化應(yīng)激及慢性炎癥反應(yīng)[8]。子癇前期具有發(fā)病早、病情發(fā)展迅速、新生兒存活率低等特點，屬于婦科臨床中難治性疾病類型[9]。

子癇前期會出現(xiàn)全身小動脈痙攣、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、靶器官血流灌注減少等病理生理變化，進(jìn)而使腎臟、肝臟以及子宮胎盤灌流等功能下降，最終影響胎兒生長發(fā)育，使其出現(xiàn)早產(chǎn)、低出生體質(zhì)量、胎兒宮內(nèi)窘迫、新生兒窒息，甚至死亡[10]。而臍動脈是連接胎兒和母體的重要物質(zhì)交換通道，其血流情況可反映胎兒及胎盤的病理生理變化[11]。彩色多普勒超聲技術(shù)可對胎兒臍動脈血流參數(shù)進(jìn)行檢測和分析，其中PI值主要反映血管搏動性，可輔助判定血管順應(yīng)性[12]；RI值主要反映血管灌注阻力(血供情況)，血供越豐富，RI值越低；而S/D也可間接反映血流灌注量及胎盤的血供情況[13]。本研究結(jié)果顯示，重度子癇前期孕婦、輕度子癇前期孕婦及正常妊娠孕婦PI、RI、S/D值依次降低，且血流動力學(xué)異常的子癇前期孕婦不良妊娠結(jié)局總發(fā)生率高于血流動力學(xué)正常的子癇前期孕婦，與朱薇等[14]研究結(jié)果基本一致。提示重度子癇前期孕婦血管灌注阻力高、血管彈性差、血供差，推測其可能原因為：重度子癇前期孕婦病理改變導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)損傷，造成胎盤絨毛小動脈痙攣、血管腔狹窄，胎盤功能降低，臍動脈舒張末期血流減少(PI、RI、S/D值增高)，最終使得進(jìn)入胎盤內(nèi)部與母體物質(zhì)交換的血流量減少，影響胎兒正常發(fā)育，不良預(yù)后發(fā)生率增加。

表6 血流動力學(xué)正常組和血流動力學(xué)異常組圍生兒預(yù)后情況比較[例(%)]

表7 子癇前期孕婦中不同圍生兒預(yù)后組產(chǎn)前HO-1 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較

HSP是一組熱休克反應(yīng)中合成的蛋白，在各種不利因素刺激下可啟動內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，發(fā)揮應(yīng)激保護(hù)效應(yīng)[15]。HO-1是HSP家族中的一員，其在胎盤組織中主要參與血流調(diào)控、血管生成、抗脂質(zhì)過氧化、抗炎等過程[16]。本研究結(jié)果顯示，子癇前期孕婦胎盤中HO-1 mRNA表達(dá)水平隨著患者病情加重而降低，與王瑩等[17]研究結(jié)果一致。提示HO-1 mRNA低表達(dá)與子癇前期病情進(jìn)展可能有關(guān)，推測子癇前期孕婦體內(nèi)過度炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致體內(nèi)HO-1消耗過多，從而發(fā)揮應(yīng)激保護(hù)效應(yīng)。NF-κB是一種普遍存在于細(xì)胞和組織中的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時NF-κB可被誘導(dǎo)激活，繼而激活其他炎性因子的表達(dá)[18]。本研究結(jié)果中子癇前期孕婦胎盤中NF-κB mRNA表達(dá)增加，且與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)。提示NF-κB可能通過高表達(dá)參與子癇前期孕婦體內(nèi)炎癥反應(yīng)。本研究中子癇前期孕婦胎盤中HO-1 mRNA表達(dá)水平與NF-κB mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，且二者均與血流參數(shù)PI、RI、S/D值相關(guān)。進(jìn)一步提示HO-1、NF-κB的相互作用及平衡失調(diào)可能參與了子癇前期的發(fā)病，進(jìn)而使得子癇前期孕婦病情加重，胎盤功能下降，用于物質(zhì)交換的血流量減少，且本研究中圍生兒預(yù)后不良孕婦產(chǎn)前血清NF-κB mRNA水平高于預(yù)后良好孕婦，HO-1 mRNA水平低于預(yù)后良好孕婦，初步推測HO-1、NF-κB可能在評估圍生兒預(yù)后情況中有重要作用。

綜上所述，子癇前期孕婦胎盤中HO-1表達(dá)水平降低、NF-κB表達(dá)水平升高，二者與胎兒臍動脈血流參數(shù)PI、RI、S/D均相關(guān)。HO-1、NF-κB與子癇前期病情進(jìn)展有密切聯(lián)系，且可能是評估圍生兒不良預(yù)后的重要指標(biāo)，為臨床開發(fā)預(yù)后評估指標(biāo)開辟新思路，同時也為今后圍生兒不良預(yù)后的預(yù)防和干預(yù)起到積極的推動作用。但還需進(jìn)一步加大樣本量來明確HO-1、NF-κB影響子癇前期疾病的分子基礎(chǔ)及其臨床應(yīng)用價值。