陳丹,楊星宇,程蔚蔚

子癇前期是妊娠期常見而復雜的并發(fā)癥，以妊娠20周后出現(xiàn)新發(fā)高血壓和蛋白尿為主要特征，發(fā)病率約2%～8%[1]。子癇前期發(fā)病機制尚未明確，目前仍缺少有效治療措施，及時終止妊娠是唯一的治療方法。有研究指出，在妊娠16周之前對高危子癇前期孕婦進行早期干預有助于改善母嬰結(jié)局[2]。因而早期生物標志物的探尋對子癇前期的診斷和防治改善母嬰結(jié)局具有重要意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一種長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，既往被認為是“轉(zhuǎn)錄噪音”[3]，然而高通量測序技術的發(fā)展促進了lncRNA在各項病理生理過程中的研究，包括子癇前期的發(fā)生發(fā)展。多項研究指出，lncRNA在子癇前期患者胎盤組織或血清中異常表達，并可通過不同作用方式及信號通路，調(diào)控靶基因的表達，進而對滋養(yǎng)層細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學功能產(chǎn)生影響，參與子癇前期的發(fā)生發(fā)展[4]。本研究通過前瞻式病例對照研究，檢測孕婦孕早期(11～13周)外周血中l(wèi)nc-C17orf64-1∶1的表達水平，探討其在子癇前期早期診斷中的預測價值，并分析其與收縮壓和舒張壓的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究為前瞻式病例對照研究，研究對象選自2018年9月至2019年9月于上海交通大學醫(yī)學院附屬國際和平婦幼保健院就診分娩的孕婦，根據(jù)妊娠結(jié)局是否發(fā)展為子癇前期分組。其中正常孕婦29例為對照組，子癇前期孕婦20例為子癇前期組。納入標準：單胎妊娠;無慢性病史;于本院規(guī)律產(chǎn)檢和分娩。子癇前期納入標準嚴格按照美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學會(ACOG)指南[5]：(1)血壓：孕前血壓正常，妊娠20周后出現(xiàn)收縮壓≥140 mmHg或舒張壓≥90 mmHg，兩次測量至少間隔4 h；收縮壓≥160 mmHg或舒張壓≥110 mmHg(重度高血壓可間隔數(shù)分鐘測定并診斷，以便及時進行降壓治療)。(2)蛋白尿：24 h蛋白尿≥300 mg；蛋白質(zhì)/肌酐≥0.3 mg/dL；尿常規(guī)蛋白≥++(僅在其他檢測方法不可用時使用)。(3)蛋白尿陰性但符合以下新發(fā)表現(xiàn)：① 血小板減少癥：血小板計數(shù)<100×109/L；② 腎功能不全：排除其他腎臟疾病，血清肌酐濃度>1.1 mg/dL或高于正常上限2倍；③ 肝功能受損：轉(zhuǎn)氨酶高于正常上限2倍；④ 肺水腫；⑤ 新發(fā)頭痛，普通藥物治療無緩解，排除其他原因或視物模糊。排除標準：(1)妊娠合并內(nèi)科或外科疾病(妊娠合并慢性高血壓、慢性高血壓并發(fā)子癇前期、糖尿病合并妊娠、妊娠期糖尿病、甲狀腺功能異常、既往或妊娠合并急慢性腎炎綜合征、腎病綜合征等)；(2)多胎妊娠或胎兒發(fā)育畸形；(3)行人工授精或試管嬰兒的孕婦；(4)孕早期無血液樣本凍存或產(chǎn)檢過程中失訪的孕婦。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，研究對象簽署知情同意書后參加。

1.2 研究方法

1.2.1 基線資料收集 收集患者年齡，體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)，診斷時收縮壓與舒張壓及24 h蛋白尿等臨床資料。

1.2.2 外周血留取 在妊娠11～13周時收集孕婦外周血3～5 mL，凍存于-80℃冰箱留用。待分娩完成，根據(jù)妊娠結(jié)局，分為子癇前期組和對照組樣本。采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測孕早期孕婦外周血中l(wèi)nc-C17orf64-1∶1的表達水平。

1.2.3 外周血lnc-C17orf64-1∶1檢測 采用Trizol法提取外周血中總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(A260/A280)測量濃度和純度后進行逆轉(zhuǎn)錄反應，生成cDNA置于-80℃的冰箱中保存。采用qRT-PCR法檢測外周血lnc-C17orf64-1∶1的表達量，以18S rRNA為內(nèi)參。每個樣本設3個復孔，結(jié)果取其均值。采用18S rRNA標準化后ΔCT值計算外周血lnc-C17orf64-1∶1的相對表達量，ΔCT值越大，外周血lnc-C17orf64-1∶1含量越低。重復3次進行統(tǒng)計分析。lnc-C17orf64-1∶1正向引物：5′-ATGGTAAAGCACCCACGAAG-3′，反向引物：5′-AGATGCTGGAAGGGAGGTTT-3′；18S rRNA正向引物：5′-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3′，反向引物：5′-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3′。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 兩組孕婦臨床特征比較

按照納入和排除標準，本研究共納入49例孕婦，其中對照組29例，子癇前期組20例。兩組對象年齡與BMI的比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與對照組相比，子癇前期組分娩孕周較小，收縮壓、舒張壓和24 h蛋白尿水平較高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),詳見表1。

2.2 兩組孕婦外周血中l(wèi)nc-C17orf64-1∶1的表達水平

子癇前期組外周血中l(wèi)nc-C17orf64-1∶1的ΔCT值小于對照組(P<0.05)，即lnc-C17orf64-1∶1在子癇前期患者外周血中呈高表達(見圖1A)。

2.3 外周血中l(wèi)nc-C17orf64-1∶1的表達與臨床病理特征的相關性

外周血中l(wèi)nc-C17orf64-1∶1的ΔCT值與收縮壓及舒張壓呈負相關(均P< 0.05)(見圖1B)。

2.4 孕早期外周血lnc-C17orf64-1∶1含量預測子癇前期效能評價

孕早期外周血lnc-C17orf64-1∶1預測子癇前期發(fā)病的ROC曲線下面積(area under the curve,AUC)為0.9172(95%置信區(qū)間：0.8445-0.9899)，靈敏度為80.00%，特異度為86.21%，最大約登指數(shù)為0.6621，根據(jù)約登指數(shù)得出最佳截斷點為13.71(ΔCT值)，陽性預測值為80.00%，陰性預測值為86.21%(見圖2)。

3 討論

子癇前期控制不良會導致孕產(chǎn)婦高血壓、蛋白尿、肝腎功能不全、凝血功能改變等，造成胎兒宮內(nèi)缺氧和生長受限，且會顯著增加患者產(chǎn)后及后代成年后罹患心血管疾病風險[1]。目前子癇前期仍缺乏有效治療方法，妊娠早期識別高危子癇前期并及時進行小劑量阿司匹林治療可顯著降低子癇前期發(fā)病風險，質(zhì)子泵抑制劑、鈣劑、他汀類藥物(普伐他汀等)、微生物制劑和二甲雙胍等臨床干預可有效幫助改善母嬰結(jié)局[1,6]。傳統(tǒng)危險因素評估預測價值有限，因此，近年來子癇前期預測指標相關研究大量開展，主要聚焦于孕婦臨床資料評估、平均動脈壓(mean artery pressure，MAP)、血清學指標[如血管內(nèi)皮生長因子、可溶性類酪氨酸激酶1、可溶性內(nèi)皮素、胎盤生長因子(placental growth factor，PLGF)、妊娠相關血漿蛋白等]和孕期超聲指標[子宮動脈搏動指數(shù)(uterine artery pulsatility index，UtA-PI)和子宮動脈收縮期最大血流速度與舒張期末期血流速度比值等][7]。目前認為，妊娠早期聯(lián)合篩查MAP、血清PLGF、UtA-PI及孕婦高危因素評估可幫助識別子癇前期高風險孕婦[8]。

圖1A 兩組外周血lnc-C17orf64-1∶1ΔCT值比較

圖1B 外周血lnc-C17orf64-1∶1ΔCT值與收縮壓、舒張壓相關性

圖2 外周血lnc-C17orf64-1∶1診斷子癇前期的ROC曲線

表1 兩組孕婦臨床特征比較

隨著高通量測序的發(fā)展，lncRNA在子癇前期中的研究逐漸興起。通過微陣列技術和RNA測序，研究者鑒定出大量在子癇前期胎盤組織中差異表達的lncRNA，并發(fā)現(xiàn)它們對滋養(yǎng)層細胞的生物學功能具有重要作用[9]。胎盤中表達上調(diào)的lncRNA INHBA-AS1通過抑制轉(zhuǎn)錄因子CENPB與腫瘤壞死因子受體相關因子1(TRAF1)的啟動子結(jié)合而抑制了滋養(yǎng)細胞的侵襲和遷移[10]；胎盤中表達下調(diào)的lncRNA HOXA11-AS可通過調(diào)節(jié)RND3和HOXA7表達影響滋養(yǎng)細胞的增殖和遷移[11]，lncRNA TUG1通過募集EZH2，抑制RND3的表達，進而抑制滋養(yǎng)層細胞的增殖、遷移、侵襲，并誘導細胞凋亡[12]。

除了lncRNA在子癇前期發(fā)病機制中的研究，研究者們還探討了其在循環(huán)血中作為子癇前期生物標志物的可能性。胎盤微陣列檢測發(fā)現(xiàn)，某些lncRNA(NR_026824.1、AK055151.1、NR_027457、NR_024178和BC030099)在子癇前期患者胎盤組織中表達上調(diào)，而Sun等[13]通過對正常孕婦及子癇前期孕婦全血樣本中上述lncRNA的檢測發(fā)現(xiàn)，僅lncRNA BC030099在外周血中表達上調(diào)，AUC為0.713(95%置信區(qū)間：0.587-0.839)。此外，有研究檢測了16周前子癇前期患者血漿中肝癌微血管侵襲相關的lncRNA MVIH的表達，分析發(fā)現(xiàn)其在子癇前期組血漿中表達降低，單獨用于預測子癇前期時，AUC為0.763，靈敏度為65.2%，特異度為75.0%，聯(lián)合尿酸、白細胞、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和尿蛋白預測可提高預測靈敏度(86.4%)和特異度(83.1%)[14]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)lnc-C17orf64-1∶1在子癇前期患者與正常孕婦臍靜脈內(nèi)皮細胞及胎盤組織中差異表達，表明其可能參與子癇前期發(fā)生發(fā)展[15]。目前我國孕婦建檔時間在妊娠12周左右，而研究也指出在妊娠11～13周時對孕婦進行各項指標檢測，可作為妊娠并發(fā)癥風險評估的首選方法[16]。因此，本研究首次檢測了lnc-C17orf64-1∶1在孕婦孕早期(妊娠11～13周)外周血中表達情況，并分析其與血壓之間的相關性，探討其作為子癇前期早期診斷生物標志物的可能性。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，lnc-C17orf64-1∶1具有較高的靈敏度和特異度，可作為預測子癇前期生物標志物。本研究也存在一定局限性，由于納入檢測的樣本量較小，且未根據(jù)子癇前期嚴重程度分組，后續(xù)需進一步行基礎研究及多中心大樣本臨床驗證明確lnc-C17orf64-1∶1在子癇前期發(fā)生發(fā)展中的作用及其在子癇前期發(fā)病的預測價值。綜上所述，lnc-C17orf64-1∶1在子癇前期患者外周血中表達升高，且與血壓嚴重程度相關，對子癇前期發(fā)病有一定的預測價值。