任雪陽，王 宇，魏勝利，楊語哲，劉曉云，宋若蘭，魏 靜，單東杰，夏 青，折改梅

·數(shù)據(jù)挖掘與循證醫(yī)學(xué)·

“保健功能-中藥-中藥”關(guān)聯(lián)的石斛保健食品配方規(guī)律分析及斑馬魚增強(qiáng)免疫力和緩解體力疲勞功能評價

任雪陽1，王 宇1，魏勝利1，楊語哲1，劉曉云1，宋若蘭1，魏 靜1，單東杰1，夏 青2*，折改梅1*

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029 2. 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東省科學(xué)院生物研究所，山東 濟(jì)南 250103

探究石斛相關(guān)保健食品的配方規(guī)律，并基于模式生物斑馬魚對含石斛的具有增強(qiáng)免疫力和緩解體力疲勞雙功能保健食品的配方進(jìn)行活性評價。對現(xiàn)有含石斛的保健食品批文中的信息資料進(jìn)行統(tǒng)計分析，利用社團(tuán)分析方法，探究石斛相關(guān)保健食品中保健功能與中藥之間的聯(lián)系規(guī)律；采用關(guān)聯(lián)和復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)機(jī)器學(xué)習(xí)算法分析石斛相關(guān)保健食品配方中中藥與中藥之間的關(guān)聯(lián)規(guī)則，以期深度挖掘其中的“保健功能-中藥-中藥”關(guān)聯(lián)性?；诖?，設(shè)計以石斛為核心原料的具有增強(qiáng)免疫力和緩解體力疲勞雙功能保健食品的候選配方；建立2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（AAPH）和甲硝唑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激斑馬魚模型及機(jī)械損傷炎癥和神經(jīng)炎癥斑馬魚模型，對其中1種候選配方進(jìn)行抗炎和抗氧化活性評價。共收集到含石斛的保健食品批文133件，保健功能以增強(qiáng)免疫力和緩解體力疲勞為主。經(jīng)篩選共得到含石斛且具增強(qiáng)免疫力和緩解體力疲勞雙功能的保健食品配方64個，所有保健功能和中藥共分為7個社團(tuán)，歸納為7種治療原則，得出相應(yīng)7種中醫(yī)證型。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)保健食品配方中高頻中藥之間具有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，并得到了核心中藥組合與核心配方，確定10種中藥配伍，設(shè)計了6個配方。斑馬魚活性實驗結(jié)果表明其中1種候選配方（石斛、枸杞子和黃芪）對斑馬魚氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)均有一定改善作用。機(jī)器學(xué)習(xí)算法指導(dǎo)中藥配方合理，為中藥類保健食品的配方研發(fā)和活性評價提供新的思路和方向。

保健食品；石斛；配方規(guī)律；機(jī)器學(xué)習(xí)算法；斑馬魚；增強(qiáng)免疫力；緩解體力疲勞；抗氧化；抗炎

石斛為蘭科植物金釵石斛Lindl.、霍山石斛C. Z. Tang et S. J. Cheng、鼓槌石斛Lindl. 或流蘇石斛Hook. 的栽培品及其同屬植物近似種的新鮮或干燥莖[1]。石斛應(yīng)用歷史悠久，具有益胃生津、滋陰清熱的功效，可改善現(xiàn)代人群普遍存在的“陰虛火旺”體質(zhì)[2-3]。近年來，石斛在保健食品、中成藥的開發(fā)中成為熱點。目前已有文獻(xiàn)對鐵皮石斛在保健食品、中成藥等方面的開發(fā)現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)分析，但運用算法分析石斛用藥規(guī)律的研究罕見[3-6]。

數(shù)據(jù)挖掘算法如關(guān)聯(lián)、復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)等可以分析數(shù)據(jù)之間的內(nèi)在規(guī)律，挖掘類群信息、關(guān)聯(lián)規(guī)則等[7]。在中醫(yī)藥領(lǐng)域，數(shù)據(jù)挖掘算法可用于構(gòu)建疾病-證候-治法-中藥-穴位等多靶點效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，挖掘“疾病-治法、治法-中藥、證型-中藥”等之間的聯(lián)系[8]。本研究引入復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析算法構(gòu)建“保健功能-中藥-中藥”多層次網(wǎng)絡(luò)，分析保健食品中保健功能和中藥、中藥和中藥之間的關(guān)系，一方面針對目前保健食品缺乏中醫(yī)證型界定的現(xiàn)狀，歸納出不同保健功能下對應(yīng)的治療原則，做出中醫(yī)證型的推薦，為石斛保健食品的辨證應(yīng)用提供參考；另一方面深度挖掘配方中的配伍規(guī)律，揭示不同保健功能對應(yīng)的核心中藥組方，以指導(dǎo)石斛保健食品的開發(fā)。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為免疫力是機(jī)體識別和消滅外來侵入異物，處理機(jī)體衰老、損傷等細(xì)胞的能力，免疫力與自由基，如活性氧（reactive oxygen species，ROS）等密切相關(guān)[9]。ROS的積聚會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，損害線粒體和細(xì)胞，使人體免疫機(jī)能下降[10]。同時，還會引起肝臟和骨骼肌線粒體的脂質(zhì)過氧化損傷，從而引發(fā)疲勞[11]。炎癥是機(jī)體應(yīng)對各種損傷性刺激時進(jìn)行自我保護(hù)的防御反應(yīng)，過度的炎癥反應(yīng)會刺激生成過多ROS，造成氧化應(yīng)激損傷[12-13]。因此，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)是提高機(jī)體免疫力、緩解體力疲勞的基礎(chǔ)。斑馬魚（，zebrafish）具有體積小、繁殖能力強(qiáng)、發(fā)育快、易于觀察、免疫系統(tǒng)高度保守等優(yōu)勢，被廣泛用于研究人類免疫、炎癥相關(guān)疾病[14-15]。

基于此，本研究通過檢索國家市場監(jiān)督管理總局（State Administration for Market Regulation，SAMR）特殊食品安全監(jiān)督管理司網(wǎng)站，對含石斛的保健食品批文進(jìn)行整理和統(tǒng)計，分析現(xiàn)有含石斛的保健食品配方、保健功能等，并通過關(guān)聯(lián)和復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)等機(jī)器學(xué)習(xí)算法深度挖掘配方規(guī)律。同時，引入模式生物斑馬魚氧化應(yīng)激模型和炎癥模型，用于石斛保健食品增強(qiáng)免疫力和緩解體力疲勞雙功能的快速評價，為保健食品配方篩選和功能評價模型提供新的選擇。

1 材料

1.1 儀器

斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)，北京愛生科技有限公司；SZX-16型體視熒光顯微鏡，日本Olympus公司；AXIO Zoom. V16型體視熒光顯微鏡，卡爾蔡司（上海）管理有限公司；Spectra MR酶標(biāo)儀，美國Dynex公司；SPX-280B-G型博訊光照培養(yǎng)箱，上?；巧锟萍加邢薰?；HPG-280BX型光照培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 試劑與試藥

鐵皮石斛（批號Y20180601），文山華信三七股份有限公司；枸杞子（批號20181010），亳州八方飲品有限公司；黃芪（批號60541002），北京同仁堂北苑雙營藥店有限責(zé)任公司；以上藥材經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院魏勝利教授分別鑒定為蘭科植物鐵皮石斛Kimura et Migo的干燥莖、茄科植物寧夏枸杞L. 的干燥成熟果實和豆科植物蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪(Fisch.) Bge. 的干燥根。候選配方4，實驗室自制（制備方法：取鐵皮石斛0.75 g、黃芪3 g、枸杞子6 g，打粉過篩，加適量輔料制粒而得），用新鮮斑馬魚培養(yǎng)水配制成2 mg/mL的母液，放入?20 ℃冰箱備用，用時以斑馬魚培養(yǎng)水稀釋成所需濃度；甲硝唑（批號J10GS53398），阿拉丁試劑（上海）有限公司，用新鮮斑馬魚培養(yǎng)水配制成10 mmol/L的甲硝唑母液；2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（AAPH），Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司，用新鮮斑馬魚培養(yǎng)水配制成25 mmol/L的AAPH母液；乙酰半胱氨酸，碧云天生物技術(shù)有限公司，用新鮮斑馬魚培養(yǎng)水配制成200 mmol/L的乙酰半胱氨酸母液；ROS染色試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；三卡因，Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司；五水硫酸銅（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用新鮮斑馬魚培養(yǎng)水配制成40 μmol/L的硫酸銅溶液；布洛芬（批號H01S9Z69098），阿拉丁試劑（上海）有限公司，用新鮮斑馬魚培養(yǎng)水配制成20 mmol/L的布洛芬溶液。

1.3 動物

本實驗選用AB系斑馬魚，Tg（krt4：NTR-hKikGR）cy17（以下簡稱cy17）系和綠色熒光標(biāo)記中性粒細(xì)胞Tg（lyz：EGFP）cz58（以下簡稱cz58）系的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，由山東省科學(xué)院生物研究所提供。斑馬魚成魚在黑暗10 h/光照14 h，（28.0±0.5）℃條件下飼養(yǎng)，每天定時定量喂食。按照實驗需要選取同品系斑馬魚按照雌雄比例1∶1放置于產(chǎn)卵缸中配對產(chǎn)卵，收取受精卵，消毒后置于黑暗10 h/光照14 h、（28.0±0.5）℃光照培養(yǎng)箱中，孵育備用。

2 方法

2.1 石斛保健食品配方規(guī)律分析

2.1.1 數(shù)據(jù)來源及納入標(biāo)準(zhǔn) 保健食品信息以“石斛”為關(guān)鍵詞，在SAMR特殊食品安全監(jiān)督管理司官網(wǎng)（http://www.samr.gov.cn/tssps/）上進(jìn)行檢索，收集截至2021年9月30日所收錄的所有保健食品批文信息，主要涉及鐵皮石斛、金釵石斛、霍山石斛等石斛屬植物。在收集整理過程中，排除沒有配方、保健功能信息的批文，共獲得到含石斛的保健食品批文133件。

2.1.2 數(shù)據(jù)庫的建立與標(biāo)準(zhǔn)化 將收集到的數(shù)據(jù)信息導(dǎo)入Microsoft Excel 2019，參照《中國藥典》2020年版[1]和《臨床中藥學(xué)》第2版[16]對保健食品批文的中藥信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理：（1）將習(xí)用名改為藥典或地方標(biāo)準(zhǔn)中記載規(guī)范名稱，如“金叉石斛”“細(xì)莖石斛”等統(tǒng)一為“石斛”；（2）將同一味藥的不同炮制規(guī)格改為原藥名，如“馬鹿茸粉”統(tǒng)一為“馬鹿茸”等；（3）將藥材提取物改為原藥材名，如“西洋參提取物”統(tǒng)一為“西洋參”；（4）將相同配方相同功效的批文合并處理；（5）若有改變名稱后功效影響顯著者，則保留原有記錄，分別錄入處理，如“生地黃”和“熟地黃”等。

2.1.3 分析方法 利用Microsoft Excel 2019對數(shù)據(jù)庫中含石斛的保健食品配方的保健功能、中藥及其類型進(jìn)行頻數(shù)統(tǒng)計。將數(shù)據(jù)庫中配方錄入中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所古今醫(yī)案云平臺V2.2.3提供的模板中，使用數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化模塊對數(shù)據(jù)再次進(jìn)行核對，獲得標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)庫，納入分析池，使用數(shù)據(jù)挖掘模塊對配方中的中藥進(jìn)行性味歸經(jīng)統(tǒng)計，并進(jìn)行社團(tuán)分析，挖掘“保健功能-中藥”之間的聯(lián)系。

應(yīng)用SPSS Modeler 18.0中的Apriori關(guān)聯(lián)規(guī)則算法和網(wǎng)絡(luò)圖分析含石斛且具有增強(qiáng)免疫力和緩解體力疲勞功能的保健食品配方中“中藥-中藥”的聯(lián)系；采用古今醫(yī)案云平臺V2.2.3數(shù)據(jù)挖掘模塊中的基于多尺度backbone算法的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析分別得到石斛增強(qiáng)免疫力、緩解體力疲勞保健食品的核心配方，最后根據(jù)以上研究結(jié)果設(shè)計配方。本研究的技術(shù)路線如圖1所示。

2.2 候選配方抑制氧化應(yīng)激和抗炎活性快速評價方法的建立

2.2.1 最小致死濃度的篩選 挑選發(fā)育1 dpf（days post fertilization，受精后天數(shù)）的AB系斑馬魚幼魚，置于12孔板中，每孔10條。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，設(shè)置8個給藥濃度，終質(zhì)量濃度分別為700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400 mg/L，同時設(shè)對照組和模型組，對照組加入2 mL新鮮斑馬魚培養(yǎng)水，模型組加入1 mL甲硝唑母液，其他各組加入對應(yīng)體積的候選配方母液和1 mL 甲硝唑母液，并用新鮮斑馬魚培養(yǎng)水補(bǔ)至2 mL，所有斑馬魚置于（28.0±0.5）℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每隔12 h統(tǒng)計，記錄斑馬魚死亡情況，計算死亡率，繪制量-毒曲線，計算最小致死濃度（minimum lethal concentration，MLC）和半數(shù)致死濃度（median lethal concentration，LC50）。

2.2.2 抑制AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚氧化應(yīng)激活性評價 挑選發(fā)育1 dpf的AB系斑馬魚幼魚，置于12孔板中，每孔10條。設(shè)置對照組、模型組、陽性對照組和候選配方組。根據(jù)MLC的篩選結(jié)果，候選配方組設(shè)置為3個給藥亞組（50、100和200 mg/L）。對照組加入2 mL新鮮斑馬魚培養(yǎng)水，陽性對照組加入2 μL乙酰半胱氨酸母液，候選配方組加入對應(yīng)體積的候選配方母液。除對照組外，其他各組均加入1 mL AAPH母液，并用新鮮斑馬魚培養(yǎng)水補(bǔ)至2 mL。給藥時間為24 h，實驗重復(fù)3次。24 h后，參照ROS試劑盒說明書對斑馬魚體內(nèi)ROS進(jìn)行染色，0.25 mg/mL三卡因麻醉，于熒光顯微鏡下采集圖片，并利用Image-pro Plus 5.1軟件統(tǒng)計各組斑馬魚的ROS熒光強(qiáng)度。

2.2.3 抑制甲硝唑誘導(dǎo)的斑馬魚氧化應(yīng)激活性評價 挑選發(fā)育1 dpf的cy17系斑馬魚幼魚，置于12孔板中，每孔10條。分組同“2.2.2”項，對照組加入2 mL新鮮斑馬魚培養(yǎng)水，陽性對照組加入2 μL乙酰半胱氨酸母液，候選配方組加入對應(yīng)體積的候選配方母液（終質(zhì)量濃度分別為50、100和200 mg/L）。除對照組外，其他各組均加入1 mL甲硝唑母液，并用新鮮斑馬魚培養(yǎng)水補(bǔ)至2 mL。給藥時間為24 h，實驗重復(fù)3次。24 h后，0.25 mg/mL三卡因麻醉，于熒光顯微鏡下采集圖片，觀察斑馬魚的皮膚熒光點數(shù)，并利用Image-pro Plus 5.1軟件統(tǒng)計各組斑馬魚的皮膚熒光點數(shù)。

2.2.4 斑馬魚抗機(jī)械損傷炎癥活性評價 挑選發(fā)育3 dpf帶有熒光的cz58系斑馬魚幼魚，置于12孔板中，每孔10條。對照組先用0.25 mg/mL三卡因麻醉，再復(fù)蘇，加入2 mL新鮮斑馬魚培養(yǎng)水。其他各組均先用0.25 mg/mL三卡因麻醉，進(jìn)行斑馬魚尾部橫切術(shù)，再復(fù)蘇；復(fù)蘇后，模型組加入2 mL新鮮斑馬魚培養(yǎng)水；陽性對照組加入2 mL布洛芬溶液；候選配方組加入對應(yīng)體積的候選配方母液（終質(zhì)量濃度分別為50、100和200 mg/L），再用新鮮斑馬魚培養(yǎng)水補(bǔ)至2 mL。給藥時間為6 h，實驗重復(fù)3次。6 h后，0.25 mg/mL三卡因麻醉，于熒光顯微鏡下采集圖片，觀察中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，并利用Image-pro Plus 5.1軟件統(tǒng)計中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移到斑馬魚機(jī)械損傷處（尾部橫切處）的熒光強(qiáng)度。

2.2.5 斑馬魚抗神經(jīng)炎癥活性評價 挑選發(fā)育3 dpf帶有熒光的cz58系斑馬魚幼魚，置于12孔板中，每孔10條。對照組和模型組分別加入2 mL新鮮斑馬魚培養(yǎng)水，陽性對照組加入2 mL布洛芬溶液；候選配方組加入對應(yīng)體積的候選配方母液（終質(zhì)量濃度分別為50、100和200 mg/L），再用新鮮斑馬魚培養(yǎng)水補(bǔ)至2 mL。給藥時間為2 h。用新鮮斑馬魚培養(yǎng)水輕柔清洗斑馬魚胚胎3～5遍，對照組加入2 mL新鮮培養(yǎng)水，其他各組加入2 mL硫酸銅溶液。給藥時間為1 h，實驗重復(fù)3次。1 h后，0.25 mg/mL三卡因麻醉，于熒光顯微鏡下采集圖片，觀察中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，并利用Image-pro Plus 5.1軟件統(tǒng)計各組斑馬魚中遷移至側(cè)線神經(jīng)丘的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

3 結(jié)果

3.1 含石斛保健食品配方規(guī)律分析

3.1.1 含石斛保健食品的保健功能、中藥及其性味歸經(jīng)頻數(shù)分析 在133件含石斛的保健食品批文信息中，共涉及保健功能12種（表1）。其中增強(qiáng)免疫力功能的最多，占比65.88%；緩解體力疲勞功能居其次，占比18.24%，可見含石斛的保健食品以增強(qiáng)免疫力和緩解體力疲勞為主要保健功能。從傳統(tǒng)功效來看，可能與石斛“厚腸胃”“平胃氣”“清胃熱”“健脾開胃”等功效密切相關(guān)[17]。

經(jīng)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，從133件含石斛的保健食品批文中共篩出保健食品配方64個。除石斛外，共涉及64種原料藥味，累計頻次為181次。出現(xiàn)頻次≥3次的共有20種中藥，排名前5位的中藥分別為西洋參、枸杞子、麥冬、人參和靈芝，具體情況見表2。

對配方中除石斛外的64種中藥進(jìn)行藥性統(tǒng)計分析。藥性統(tǒng)計按出現(xiàn)頻次高低依次為平性（31.21%）、涼性（24.86%）、微寒（15.03%）、溫性（13.29%）、微溫（9.25%）及寒性（6.36%），可見與石斛配伍的中藥多為平性、涼性藥；藥味按出現(xiàn)頻次高低依次為甘（51.06%）、微苦（17.96%）、苦（11.62%）、辛（7.39%）、酸（4.23%）、淡（2.46%）、咸（2.11%）、澀（1.41%）及微甘（1.06%），甘味藥居多，符合甘能補(bǔ)的藥味特性[18]；歸經(jīng)按出現(xiàn)頻次高低依次為肺（25.32%）、腎（20.68%）、心（18.14%）、肝（12.45%）、脾（12.24%）、胃（8.65%）、大腸（1.27%）、膽（0.63%）、膀胱（0.21%）、心包（0.21%）及小腸（0.21%），可見與石斛配伍的中藥跟五臟均相關(guān)，以歸肺經(jīng)、腎經(jīng)和心經(jīng)的藥味最多。

表1 含石斛的保健食品的保健功能頻數(shù)統(tǒng)計

Table 1 Frequency statistics of health-care functions of health products containing DendrobiiCaulis

保健功能頻數(shù)/次占比/%保健功能頻數(shù)/次占比/% 增強(qiáng)免疫力11265.88延緩衰老31.76 緩解體力疲勞 3118.24對輻射危害有輔助保護(hù)功能21.18 清咽潤喉 7 4.12改善睡眠10.59 對化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能 4 2.35緩解視力疲勞10.59 提高缺氧耐受力 4 2.35抗突變10.59 調(diào)節(jié)血糖 3 1.76抗氧化10.59

表2 含石斛的保健食品配方中中藥頻數(shù)統(tǒng)計(頻數(shù)≥3)

Table 2 Frequency statistics of traditional Chinese medicines in health products containing DendrobiiCaulis (frequency ≥ 3)

中藥頻數(shù)/次占比/%中藥頻數(shù)/次占比/% 西洋參3046.88三七34.69 枸杞子1421.88玉竹34.69 麥冬 812.50丹參34.69 人參 710.94靈芝孢子粉34.69 靈芝 710.94葛根34.69 山藥 6 9.38玄參34.69 黃芪 6 9.38淫羊藿34.69 茯苓 5 7.81馬鹿茸34.69 黃精 5 7.81絞股藍(lán)34.69 當(dāng)歸 4 6.25五味子34.69

3.1.2 含石斛保健食品的“保健功能-中藥”社團(tuán)分析 將篩選出的64個保健食品配方錄入古今醫(yī)案云平臺V2.2.3提供的模板，各配方中中藥列入“中藥組成”項，其對應(yīng)的保健功能列入“綜合療效”項。利用數(shù)據(jù)挖掘模塊中的社團(tuán)分析功能，選擇前項為“療效”，后項為“中藥”，進(jìn)行社團(tuán)分析。社團(tuán)結(jié)構(gòu)是節(jié)點間因不同的連接程度所形成的結(jié)構(gòu)。圖2中每個節(jié)點代表1種保健功能或中藥，“中藥”節(jié)點圍繞“保健功能”節(jié)點形成1個小社團(tuán)，代表該保健功能下的常用中藥。

圖2中所有保健功能和中藥組成1個大網(wǎng)絡(luò)，整個大網(wǎng)絡(luò)由7個小社團(tuán)構(gòu)成，各個小社團(tuán)以顏色區(qū)分。其中，西洋參、枸杞子、麥冬和人參等17味中藥與3個及3個以上社團(tuán)、3個及3個以上保健功能均有連線，是小社團(tuán)重疊較高的部分，這與頻次統(tǒng)計得到的高頻中藥基本相同。頻次統(tǒng)計偏重以數(shù)字的形式表明用藥頻次的高低；社團(tuán)分析偏重以圖形形式展示保健功能與中藥之間的疏密聯(lián)系，2種方式可互為補(bǔ)充。每個社團(tuán)的保健功能和主要中藥見表3。

由圖2和表3可知，改善睡眠、對化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能同歸為1號社團(tuán)，主要中藥丹參、五味子等多歸心經(jīng)和肝經(jīng)。化學(xué)性肝損傷的病因是感受毒邪，病位主要在肝。中醫(yī)認(rèn)為不寐屬心神病變，主要由情志內(nèi)傷等引起。肝主情志，可見失眠與肝有著密切的相關(guān)性，二者歸同一社團(tuán)，治則為養(yǎng)心補(bǔ)肝，適用于肝血虧虛證。這與臨床上失眠“從肝論治”的理論相一致[19]。2號社團(tuán)包含增強(qiáng)免疫力、對輻射危害有輔助保護(hù)功能和抗突變，3者均與免疫系統(tǒng)相關(guān)，用藥多有重疊，以益氣養(yǎng)陰為主，并兼有補(bǔ)血養(yǎng)血，對應(yīng)氣血兩虛證[20]。提高缺氧耐受力和清咽潤喉同歸為4號社團(tuán)，甘味藥、苦味藥居多，歸經(jīng)多為肺經(jīng)，以清熱潤肺滋陰為主，適合陰虛肺燥證。3號、5號、6號和7號社團(tuán)分別對應(yīng)緩解體力疲勞、調(diào)節(jié)血糖、延緩衰老和緩解視力疲勞，治則分別為滋補(bǔ)肝腎、滋陰健脾、養(yǎng)陰清熱、清肝明目，分別對應(yīng)肝腎虧虛證、陰虛胃熱證、氣陰兩虛證和肝火上擾證的人群。

3.1.3 含石斛的增強(qiáng)免疫力、緩解體力疲勞保健食品配方規(guī)律分析 分別對含石斛且具有增強(qiáng)免疫力、緩解體力疲勞功能的保健食品配方中單味中藥進(jìn)行頻數(shù)分析，除石斛外頻次排序前8的中藥分布見表4。可見增強(qiáng)免疫力、緩解體力疲勞2種保健功能中，西洋參和枸杞子均為其高頻藥味。

進(jìn)一步分別對增強(qiáng)免疫力、緩解體力疲勞保健食品中與石斛配伍的中藥的性味歸經(jīng)進(jìn)行統(tǒng)計。與石斛配伍的中藥藥性以平性和涼性為主，藥味以甘、微苦為主，主要歸肺經(jīng)、腎經(jīng)和心經(jīng)。說明增強(qiáng)免疫力和緩解體力疲勞2種保健功能配方中中藥屬性基本相似。

圖2 基于社團(tuán)分析的含石斛保健食品保健功能和藥味的關(guān)聯(lián)分析

表3 不同保健功能及對應(yīng)的主要中藥

Table 3 Different health-care functions and corresponding main traditional Chinese medicines

表4 含石斛的增強(qiáng)免疫力、緩解體力疲勞保健食品配方中中藥頻次統(tǒng)計(排序前8位)

Table 4 Frequency statistics of traditional Chinese medicines in health products containing DendrobiiCaulis with enhancing immunity and alleviating physical fatigue functions (top eight)

增強(qiáng)免疫力緩解體力疲勞 中藥頻數(shù)/次占比/%中藥頻數(shù)/次占比/% 西洋參2520.33西洋參1227.91 枸杞子10 8.13枸杞子 511.63 麥冬 7 5.69淫羊藿 3 6.98 人參 6 4.88黃精 2 4.65 黃芪 5 4.07靈芝 2 4.65 靈芝 5 4.07馬鹿茸 2 4.65 茯苓 4 3.25人參 2 4.65 山藥 4 3.25山藥 2 4.65

進(jìn)一步分別對具有增強(qiáng)免疫力和緩解體力疲勞功能的保健品中排序前20位的中藥進(jìn)行Apriori算法分析和網(wǎng)絡(luò)分析，以支持度＞10%、置信度＞50%作為篩選條件，得到常見中藥組合和網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果如表5和圖3所示。支持度表示在所有數(shù)據(jù)中關(guān)聯(lián)中藥出現(xiàn)的比例；置信度表示關(guān)聯(lián)中藥之間聯(lián)系的強(qiáng)度；提升度主要是用來衡量關(guān)聯(lián)規(guī)則的前項與后項間的獨立性，提升度的大小與相關(guān)性的強(qiáng)弱呈正相關(guān)[21-23]。由表5可知，在增強(qiáng)免疫力的中藥組合中，關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的分別是靈芝和西洋參、枸杞子和西洋參的配伍；在緩解體力疲勞的原料中藥組合中，關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的是淫羊藿和西洋參、靈芝和西洋參、黃精和西洋參、枸杞子和西洋參的配伍。

表5 基于Apriori算法的含石斛的具有增強(qiáng)免疫力、緩解體力疲勞保健食品配方中常見中藥的二次關(guān)聯(lián)分析

Table 5 Quadratic association analysis of common traditional Chinese medicines in health products containing DendrobiiCaulis with enhancing immunity and alleviating physical fatigue functions based on Apriori algorithm

保健功能原料中藥組合實例支持度/%置信度/%提升度 增強(qiáng)免疫力靈芝→西洋參 510.64 60.001.13 枸杞子→西洋參1010.64 60.001.13 緩解體力疲勞淫羊藿→西洋參 318.75100.001.33 靈芝→西洋參 212.50100.001.33 黃精→西洋參 212.50100.001.33 枸杞子→西洋參 531.25 60.000.80

圖3 含石斛的具有增強(qiáng)免疫力(A) 和緩解體力疲勞(B) 功能保健食品配方中中藥網(wǎng)絡(luò)分析

為進(jìn)一步揭示常見中藥之間的關(guān)系，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。從圖3可以看出，在增強(qiáng)免疫力保健功能的中藥組合中，枸杞子與西洋參相關(guān)性良好，同時靈芝與西洋參、茯苓與山藥的相關(guān)性連接線也比較清晰，關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)；在緩解體力疲勞保健功能的中藥組合中，西洋參與枸杞子、淫羊藿、靈芝、黃精的關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)。

借助古今醫(yī)案云平臺V2.2.3數(shù)據(jù)挖掘模塊中的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析功能，基于多尺度backbone算法，對“中藥-中藥”的關(guān)聯(lián)規(guī)律進(jìn)行進(jìn)一步分析，以反映中藥的重要性及其相互關(guān)系。數(shù)據(jù)錄入方法同“3.1.2”項，選擇前項為“中藥”，后項為“中藥”，類型為“多尺度的backbone網(wǎng)絡(luò)算法”，設(shè)置參數(shù)布局為concentric、邊權(quán)重為1，提取中藥組合網(wǎng)絡(luò)，見圖4。含石斛的具有增強(qiáng)免疫力功能保健食品配方的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)圖中共有46味中藥，核心配方為石斛、西洋參、枸杞子、人參、山藥和麥冬。含石斛的具有緩解體力疲勞功能保健食品配方的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)圖中共有21味中藥，核心配方為石斛、西洋參和枸杞子。

圖4 基于多尺度backbone算法的含石斛的具有增強(qiáng)免疫力(A) 和緩解體力疲勞(B) 保健食品配方的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析

綜合以上分析結(jié)果，篩選出石斛、西洋參、人參、黃芪、枸杞子、淫羊藿、麥冬、山藥、靈芝和黃精共10味中藥進(jìn)行配方。綜合社團(tuán)分析所得的增強(qiáng)免疫力和緩解體力疲勞保健食品“益氣養(yǎng)陰”和“滋補(bǔ)肝腎”的治療原則，共形成6個配方。參考《中國藥典》2020年版一部中藥材和飲片的規(guī)定用量、現(xiàn)有保健食品批文、中成藥中相關(guān)藥味的用量，并結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)古籍、藥理作用研究相關(guān)文獻(xiàn)等，設(shè)計藥味的用量，配方信息見表6。因后期擬選擇候選配方4進(jìn)行增強(qiáng)免疫力和緩解體力疲勞雙功能保健食品的研究與開發(fā)，故本研究選取配方4進(jìn)行斑馬魚抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的活性評價。

3.2 保健食品候選配方4抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)活性評價

3.2.1 最小致死濃度的篩選 AB系斑馬魚是一種野生型斑馬魚，經(jīng)過多代培育后，具有清晰的遺傳背景，可用于安全性和一般活性的評價[24]。本實驗分析了候選配方4對AB系斑馬魚的最小致死濃度，并結(jié)合斑馬魚的狀態(tài)，來確定給藥劑量。由候選配方4對斑馬魚致死率的量-毒曲線（圖5）可知，候選配方4的LC50值為966.166 mg/L。利用SPSS（Version 25.0）計算得到候選配方4的MLC值為778.152 mg/L。在劑量篩選中發(fā)現(xiàn)，候選配方4質(zhì)量濃度400～800 mg/L下，斑馬魚胚胎出現(xiàn)了魚鰾變小、卵黃囊吸收遲滯、心包水腫形態(tài)異常等一系列畸形癥狀，故實驗中設(shè)定候選配方4低、中、高劑量分別為50、100、200 mg/L。

表6 含石斛的具有增強(qiáng)免疫力和緩解體力疲勞功能的保健食品候選配方

Table 6 Candidate formulas of health products containing DendrobiiCaulis with functions of enhancing immunity and alleviating physical fatigue

編號君藥臣藥佐/使藥 1石斛（0.75 g）西洋參（1.5 g）枸杞子（6 g） 2石斛（0.75 g）西洋參（1.5 g）黃精（3 g） 3石斛（0.75 g）西洋參（1.5 g）淫羊藿（2 g） 4石斛（0.75 g）黃芪（3 g）枸杞子（6 g） 5石斛（0.75 g）人參（1 g）麥冬（2 g） 6石斛（0.75 g）山藥（5 g）靈芝（2 g）

3.2.2 抑制斑馬魚氧化應(yīng)激活性評價 如表7和圖6所示，在AAPH誘導(dǎo)的AB系斑馬魚氧化應(yīng)激模型中，與對照組比較，模型組斑馬魚體內(nèi)熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（＜0.05），表明造模成功。經(jīng)過候選配方4處理后，斑馬魚熒光強(qiáng)度有所降低，表明候選配方4對斑馬魚的氧化應(yīng)激損傷有改善作用。隨著候選配方4濃度的提高，斑馬魚體內(nèi)熒光強(qiáng)度逐步減小。當(dāng)濃度增加到200 mg/L時，熒光強(qiáng)度最小，并呈現(xiàn)出顯著性差異（＜0.05）。

圖5 候選配方4斑馬魚量-毒曲線

表7 候選配方4對斑馬魚氧化應(yīng)激損傷的改善作用()

Table 7 Effect of candidate formula 4 on oxidative stress damage in zebrafish()

組別劑量/(mg·L?1)IOD熒光點數(shù)/個 對照－1 006 054.91±218 675.78375.10±23.66 模型－2 020 931.73±382 838.09+94.40±19.90+ 陽性對照－1 376 616.90±373 544.71+*327.10±29.71+* 候選配方4 501 751 877.59±242 467.23+114.20±19.58+ 1001 788 052.99±13 305.17+192.30±20.02+* 2001 620 115.77±143 329.08+*202.00±14.97+*

與對照組比較：+＜0.05；與模型組比較：*＜0.05，表8同

+< 0.05control group;*< 0.05model group, same as table 8

在甲硝唑誘導(dǎo)的cy17系轉(zhuǎn)基因斑馬魚氧化應(yīng)激模型中，與對照組比較，模型組斑馬魚皮膚熒光點數(shù)顯著降低（＜0.05），陽性對照組熒光點數(shù)顯著增加（＜0.05）。經(jīng)過候選配方4處理后，斑馬魚皮膚熒光點數(shù)隨著候選配方4濃度的升高，熒光點數(shù)逐步增加，中、高劑量組顯著高于模型組（＜0.05），表明候選配方4具有較好的抑制斑馬魚氧化應(yīng)激損傷的作用。

3.2.3 抗機(jī)械損傷和抗神經(jīng)炎癥活性評價 候選配方4抗機(jī)械損傷和抗神經(jīng)炎癥的評價結(jié)果見表8和圖7。在尾部橫切術(shù)導(dǎo)致的機(jī)械損傷炎癥模型中，相較于對照組，模型組斑馬魚中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移到機(jī)械損傷區(qū)域處的數(shù)量（以機(jī)械損傷區(qū)域的熒光強(qiáng)度計）顯著升高（＜0.05），說明斑馬魚斷尾炎癥模型構(gòu)建成功，機(jī)械損傷造成了斑馬魚的炎癥反應(yīng)。與模型組相比，經(jīng)過候選配方4處理后，斑馬魚機(jī)械損傷區(qū)域處的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著減少，且呈劑量相關(guān)性。在硫酸銅導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥模型中，相較于對照組，模型組中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移到斑馬魚側(cè)線的數(shù)量（熒光點數(shù)量）顯著增加（＜0.05），說明硫酸銅造成了斑馬魚的炎癥反應(yīng)。與模型組相比，經(jīng)過候選配方4處理后，斑馬魚中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移到斑馬魚側(cè)線的數(shù)量顯著降低（＜0.05），且隨著給藥濃度的升高，熒光點數(shù)逐步減少。表明候選配方4對硫酸銅造成的斑馬魚的炎癥有顯著的改善作用，且與給藥濃度呈正相關(guān)。以上結(jié)果說明候選配方4具有顯著的抗炎作用。

A、B-候選配方4改善AAPH誘導(dǎo)的AB系斑馬魚氧化應(yīng)激損傷情況 C、D-候選配方4改善甲硝唑誘導(dǎo)的cy17系斑馬魚氧化應(yīng)激損傷情況與對照組比較：+P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05，圖7同

表8 候選配方4對斑馬魚炎癥反應(yīng)的改善作用()

Table 8 Effect of the candidate formula 4 on inflammation in zebrafish()

分組劑量/(mg·L?1)IOD遷移數(shù)量/個 對照－207 928.01±8 755.531.50±0.71 模型－462 224.19±46 709.52+34.80±5.27+ 陽性對照－256 268.53±59 804.75*8.70±2.63+* 候選配方4 50346 856.04±27 694.39+*23.70±3.65+* 100279 195.53±51 439.47+*18.50±5.68+* 200257 988.27±47 204.36*13.50±3.34+*

A、B-候選配方4對機(jī)械損傷炎癥的改善情況 C、D-候選配方4對神經(jīng)炎癥的改善情況

4 討論

本研究對國家市場監(jiān)督管理總局于2021年9月30日前公布的含石斛的保健食品批文中的保健功能、中藥及性味歸經(jīng)等進(jìn)行統(tǒng)計分析。在此基礎(chǔ)上，引入社團(tuán)分析方法，挖掘保健功能和中藥之間的關(guān)系。社團(tuán)分析是復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)算法的一種，社團(tuán)結(jié)構(gòu)是復(fù)雜系統(tǒng)模塊性和層次性的本質(zhì)表現(xiàn)[8]。本研究采用社團(tuán)分析“保健功能-中藥”的關(guān)系，將保健功能和中藥分為7個社團(tuán)，歸納為7種治則，做出了中醫(yī)證型的推薦，為石斛保健食品的辨證應(yīng)用提供參考。社團(tuán)分析結(jié)果與中醫(yī)理論有一定相關(guān)性，表明不同保健功能可能對應(yīng)相同的病機(jī)，治則具有一致性。社團(tuán)分析中也存在因病機(jī)一致某些中藥屬于多個社團(tuán)的情況，提示保健食品配方應(yīng)考慮辨證應(yīng)用，注意中藥的配伍使用。

含石斛的保健食品共涉及11種保健功能，以增強(qiáng)免疫力和緩解體力疲勞為主。Apriori算法是最經(jīng)典的關(guān)聯(lián)規(guī)則算法，通過逐層搜索的方式迭代尋找數(shù)據(jù)庫中所有項集的關(guān)系，以形成規(guī)則[25]。Apriori算法在中醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，用以分析配伍規(guī)律，挖掘數(shù)據(jù)中的內(nèi)部聯(lián)系[26]。復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)是以網(wǎng)絡(luò)化建模形式研究復(fù)雜現(xiàn)象的一種分析方法，可以深入刻畫傳統(tǒng)中醫(yī)復(fù)雜體系內(nèi)部的關(guān)系和特點[27]。本研究基于Apriori算法分析結(jié)果與復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析所獲得的核心配方組成，綜合藥味頻數(shù)統(tǒng)計分析情況，篩選出核心藥味石斛、西洋參、人參、黃芪、枸杞子、淫羊藿、麥冬、山藥、靈芝和黃精10種中藥進(jìn)行配伍，得到6個候選配方，并選取其中之一進(jìn)行功能評價。

從傳統(tǒng)中醫(yī)理論來看，候選配方4中鐵皮石斛滋陰、清熱生津為君藥，扶正同時祛邪；黃芪補(bǔ)氣升陽、生津養(yǎng)血、利水；枸杞子補(bǔ)肝腎、益精，二者為臣藥，協(xié)同輔助鐵皮石斛扶持正氣。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也證實鐵皮石斛、枸杞子和黃芪均具有增強(qiáng)免疫力[28-30]、緩解體力疲勞[31-33]的作用。其中，鐵皮石斛含有多糖、黃酮和生物堿等多種化學(xué)成分[34]。以往認(rèn)為，多糖是主要藥效成分，常用作品質(zhì)評價的重要指標(biāo)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)聯(lián)芐類、黃酮類成分具有抗炎、抗氧化、提高免疫等作用[35]。提高機(jī)體免疫力、緩解體力疲勞的關(guān)鍵在于抑制機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。近年來。斑馬魚作為模式生物在食品研發(fā)、藥物研發(fā)、毒性和有效性評價及疾病模型建立等方面應(yīng)用廣泛[36]。本實驗采用AAPH誘導(dǎo)的AB系轉(zhuǎn)基因斑馬魚和甲硝唑誘導(dǎo)的cy17系轉(zhuǎn)基因斑馬魚氧化應(yīng)激模型對候選配方4進(jìn)行活性評價，發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗氧化活性。在硫酸銅誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥模型和尾部橫切術(shù)造模的機(jī)械損傷炎癥模型中，候選配方4可顯著緩解2種模型斑馬魚的炎癥反應(yīng)，具有良好的抗炎活性。

綜上所述，本研究結(jié)合關(guān)聯(lián)分析和復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析等算法探討石斛保健食品的配方規(guī)律，構(gòu)建了“保健功能-中藥-中藥”網(wǎng)絡(luò)，得到石斛增強(qiáng)免疫力和緩解體力疲勞保健食品配方中的核心藥對和配方，為后期配方篩選提供了思路。本實驗建立的斑馬魚增強(qiáng)免疫力和抗疲勞功能評價模型造模周期短、檢測指標(biāo)科學(xué)合理、客觀、靈敏易測。候選配方4具有良好的抑制氧化應(yīng)激和抗炎作用，說明機(jī)器學(xué)習(xí)算法指導(dǎo)配方的合理性，為保健食品活性評價提供新的思路和方向。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Analysis on formula regularity of health products containingbased on “health functions-traditional Chinese medicines-traditional Chinese medicines” and evaluation of enhancing immunity and alleviating physical fatigue functions based on zebrafish

REN Xue-yang1, WANG Yu1, WEI Sheng-li1, YANG Yu-zhe1, LIU Xiao-yun1, SONG Ruo-lan1, WEI Jing1, SHAN Dong-jie1, XIA Qing2, SHE Gai-mei1

1. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 2. Biology Institute, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), Jinan 250103, China

To explore the formulation regularity of health products containing Shihu ()and to evaluate enhancing immunity and alleviating physical fatigue functions of health products containingbased on zebrafish model.The information of the approval documents on health products containingwere statistically analyzed. Community analysis method was used to analyze the relation and regulation between health functions and traditional Chinese medicines. association analysis and complex network analysis based on Apiror and multi-scale backbone algorithms were used to analyze the association rules between traditional Chinese medicines in health products formula containing Dendrobii Caulis, in order to deeply explore the relations of “health functions-traditional Chinese medicines-traditional Chinese medicines” of all the traditional Chinese medicines in health products formula with enhancing immunity and alleviating physical fatigue functions. By combining all the analysis results, candidate formulas with enhancing immunity and alleviating physical fatigue functions were designed withas the main ingredient. Based on 2,2′-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH)-induced and metronidazole-induced oxidative stress models and inflammation model of zebrafish, anti-inflammatory and anti-oxidant activities of one of the candidate formulas were evaluated.A total of 133 health products containingwere collected in which health function consist largely of enhancing immunity and alleviating physical fatigue. And 64 health products formulations containingwere obtained. All the health functions and traditional Chinese medicines were divided into seven communities, and they were summarized seven therapeutical principles and were classified seven syndrome patterns. It was found that the high-frequency traditional Chinese medicines have a stronger correlation with each other, and the core formulas were obtained based on correlation analysis and complex network analysis. The compatibility of 10 kinds of traditional Chinese medicines was determined and six formulations were designed. The results of zebrafish activity experiment showed that one of the candidate formulas (,and) had certain ameliorating effects on oxidative stress injury and inflammatory response of zebrafish.This study suggests that machine learning algorithm is reasonable to guide the formula of traditional Chinese medicines and it is expected to provide new ideas and methods for the development and activity evaluation of Chinese medicinal health products.

health products;; formulation regularity; machine learning algorithms; zebrafish; enhancing immunity; alleviating physical fatigue; anti-oxidant; anti-inflammatory

R283.21；R285

A

0253 - 2670(2022)08 - 2435 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.021

2021-11-21

北京市科技計劃課題（Z201100005420005）；桂林市技術(shù)創(chuàng)新引導(dǎo)計劃（2020010902）

任雪陽（1996—），女，碩士，研究方向為中藥化學(xué)。E-mail: renxueyang1996@163.com

折改梅（1976—），博士生導(dǎo)師，研究員，從事中（民族）藥藥效成分和新藥創(chuàng)制研究。E-mail: shegaimei@126.com

夏 青（1988—），副研究員，從事中藥品質(zhì)評價與分子機(jī)制研究。E-mail: sdxq1021@163.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]