曲中原，羅龍?zhí)?，張文君，?揚，楊小龍，邴一凡，王淇漩，李文蘭, 2，鄒 翔

基于UPLC-Q-TOF-MS/MS和網(wǎng)絡藥理學方法探討五味子藤莖保肝的潛在藥效物質及作用機制

曲中原1，羅龍?zhí)?，張文君1，胡 揚1，楊小龍1，邴一凡1，王淇漩1，李文蘭1, 2，鄒 翔2, 3*

1. 哈爾濱商業(yè)大學藥學院 中藥學專業(yè)教研室，黑龍江 哈爾濱 150076 2. 哈爾濱商業(yè)大學藥學院 藥物工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076 3. 哈爾濱宇洲仁泰藥物工程研究中心有限公司，黑龍江 哈爾濱 150076

基于高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質譜法（UPLC-Q-TOF-MS/MS）分析五味子藤莖的主要成分，并結合網(wǎng)絡藥理學和分子對接方法預測保肝藥效物質和潛在的作用靶點及通路。根據(jù)UPLC-Q-TOF-MS/MS二級質譜裂解碎片信息，并結合文獻數(shù)據(jù)，對五味子藤莖化學成分進行分析鑒定；通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），從鑒定獲得的化學成分中篩選出口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且符合類藥五原則的活性成分；運用TCSMP數(shù)據(jù)庫和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫查找和預測五味子藤莖的成分靶點；通過在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、GeneCards數(shù)據(jù)庫和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫篩選疾病靶點。采用String11.5數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 3.7.2軟件構建PPI網(wǎng)絡，并篩選核心靶點。利用DAVID 6.8進行基因本體（gene ontology，GO）注釋和KEGG通路富集分析，并通過AutoDockTools 1.5.6軟件對五味子藤莖的活性成分與作用靶點進行分子對接驗證。構建酒精致肝細胞損傷體外模型，并考察五味子藤莖提取物對肝損傷細胞的保護作用。從五味子藤莖中共鑒定出40個主要成分，包括木脂素類、黃酮類、有機酸類化合物；進一步篩選出活性成分12個，活性成分與疾病交集靶點118個；通過網(wǎng)絡拓撲篩選獲得核心靶點16個；富集分析發(fā)現(xiàn)五味子藤莖保肝作用主要涉及的通路包括：腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、丙型肝炎（hepatitis C）、乙型肝炎（hepatitis B）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路等。分子對接結果表明，五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酯甲、槲皮素、戈米辛M2、戈米辛R等成分可與表皮生長因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α（phosphatidylinositol-3-kinase catalytic subunit alpha isoform，PIK3CA）、TNF、人半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartic protease-3，Caspase-3）等靶點蛋白發(fā)生相互作用，結合活性良好。五味子藤莖可抑制酒精引起的人正常肝細胞系L-02存活率降低，降低谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性。五味子藤莖具有保肝作用，主要藥效物質為木脂素類，可通過多靶點、多通路發(fā)揮保肝作用。

五味子藤莖；保肝；活性成分；網(wǎng)絡藥理學；分子對接；五味子甲素；五味子乙素；五味子丙素；五味子酯甲；槲皮素；戈米辛M2；戈米辛R

肝臟是人體最重要的內臟器官之一，涉及膽汁分泌、解毒排泄、生物代謝與轉化、凝血因子合成及免疫等多種重要的生物過程[1]。作為人體最主要的解毒器官，肝臟更易受到各種因素的影響而受到損傷。研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染、酗酒、藥物濫用、高脂飲食、不良情緒等都是引起肝損傷的主要原因。目前，我國仍是全世界肝病患病人數(shù)最多和肝病負擔最重的國家[2]。因此，保護肝臟對維持人體健康，防治相關疾病發(fā)生具有重要意義?，F(xiàn)代研究表明，中藥憑借其多成分、多靶點的特點，在保肝方面發(fā)揮重要的作用。五味子、柴胡、葛根、金銀花、龍膽等多種中草藥都具有明確的保肝護肝作用[3]。其中，五味子是木蘭科植物五味子(Turcz.) Baill的干燥成熟果實，具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心之功效[4]，是傳統(tǒng)的保肝中藥，在保肝經(jīng)典方劑扶正化瘀方以及中成藥護肝片中均含有五味子[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，五味子藤莖含有與果實相同的木脂素類成分，且含量較高[7]。同時，五味子藤莖木脂素可顯著降低四氯化碳（CCl4）急性肝損傷模型小鼠血清谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性和三酰甘油（triacylglycerol，TG）水平；五味子藤莖木脂素和多糖可顯著升高肝臟中超氧化物歧化酶的活性，降低肝臟中丙二醛的含量，進而發(fā)揮保肝作用[8]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，五味子藤莖提取物可降低肝纖維化模型大鼠血清及肝組織中透明質酸、層黏連蛋白、Ⅲ型前膠原水平，進而發(fā)揮抗肝纖維化的作用，且其機制可能與降低肝組織轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表達水平，與抑制肝星狀細胞的活化和阻止肝纖維化時細胞外基質的產(chǎn)生和蓄積有關[9]。上述研究均表明，五味子藤莖也具有較好的保肝作用，具有一定的開發(fā)應用前景。但在以往的種植過程中，為了五味子的增產(chǎn)，每年大量的五味子藤莖被剪枝丟棄，造成了資源的極大浪費[10]。

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術分析五味子藤莖的化學成分，利用網(wǎng)絡藥理學及分子對接等手段探究其保肝作用的靶點和分子機制，為五味子藤莖這一藥用資源的合理開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞

人正常肝細胞系L-02，由哈爾濱商業(yè)大學抗腫瘤天然藥物教育部工程研究中心提供。

1.2 藥品與試劑

五味子藤莖采于黑龍江中醫(yī)藥大學藥用植物園，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學藥學院曲中原教授鑒定為木蘭科植物五味子(Turcz.) Baill的藤莖；對照品五味子醇甲（MUST-18031905，質量分數(shù)99.46%）、戈米辛J（MUST-18041102，質量分數(shù)98.28%）、戈米辛M2（MUST-18010412，質量分數(shù)98.75%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司；對照品五味子醇乙（AM407S）、五味子甲素（AM268S）、五味子乙素對照品（AB266S）、五味子丙素（AM509W）、五味子酯甲（批號MUST-18041108），購自天津一方科技有限公司，質量分數(shù)均≥98%；色譜甲醇、乙腈購自德國默克公司；色譜甲酸購自美國Fisher公司；PBS緩沖液、胰蛋白酶、胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；DMSO購自天津巴斯夫化工有限公司；青鏈霉素雙抗購自美國Hyclone公司；ALT測定試劑盒、AST測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；聯(lián)苯雙酯（內蒙古蘭太藥業(yè)有限責任公司）；水為屈臣氏蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.3 儀器

ACQUITY UPLC（美國Waters公司）；AB SCEIX Triple-TOFTM 5600型質譜儀（美國應用生物系統(tǒng)公司）；CO-150型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國NBS公司）；iMark酶標儀（上海伯樂生命醫(yī)藥產(chǎn)品有限公司）；Olympus CKX41SF型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；超低溫冰箱（英國NBS公司）。

1.4 數(shù)據(jù)庫與軟件

中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，https://tcmspw.com/index.php），PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；SwissTargetPred iction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）；在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，http://www. omim.org/）；GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.gene cards.org/）；KEGG數(shù)據(jù)庫（http://www.kegg. jp/）；UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）；DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）；蛋白結構數(shù)據(jù)庫（PDB，http://www.rcsb.org/）；Cytoscape 3.7.2軟件；AutoDockTools1.5.6軟件；PyRx0.8軟件；PyMOL2.1.1軟件；GraphPad Prism 8.0。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 五味子藤莖樣品溶液 稱取五味子藤莖1 g，加10倍量的乙醇回流提取2 h，之后取濾渣再提取1 h，合并2次濾液，濃縮。取浸膏加乙腈復溶，25 mL量瓶定容，制成質量濃度為0.04 g/mL五味子藤莖供試品溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，備用。

2.1.2 對照品溶液 精密稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酯甲、戈米辛J、戈米辛M2對照品各1 mg，分別加甲醇超聲溶解，5 mL量瓶定容，制成0.2 mg/mL的對照品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱，流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～3 min，23% B；3～7 min，23%～40% B；7～8 min，40%～42% B；8～11.5 min，42%～55% B；11.5～13 min，55%～65% B；13～14.5 min，65%～75% B；14.5～19 min：75%～100% B；19～28 min：100%～23% B。體積流量0.2 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量5 μL，檢測波長216 nm。

2.3 質譜條件

離子化模式為電噴霧正、負離子模式，正負離子源電壓分別為5500 V和?4500 V，離子源溫度為550 ℃，裂解電壓（DP）分別為80、?80 V，碰撞能量分別為35、?35 eV，碰撞能量擴展分別為15、?15 eV。霧化氣（gas1）為380 kPa，輔助氣（gas 2）為35 kPa，氣簾氣（curtain gas）為240 kPa。一級質譜母離子掃描范圍為/80～1500，IDA設置響應值超過100 cps的8個最高峰進行二級質譜掃描，子離子掃描范圍為/50～1500。

2.4 基于網(wǎng)絡藥理學五味子藤莖保肝作用機制預測

選取鑒定的全部五味子藤莖成分為目標成分，將其分別輸入TCMSP和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫，根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%條件和Lipinski類藥五原則篩選其活性成分[11-12]。采用TCMSP數(shù)據(jù)庫和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫查找和預測成分靶點，合并去重后獲得五味子藤莖成分靶點。采用OMIM、GeneCards、KEGG數(shù)據(jù)庫，以“hepatitis”與“hepatic injury”為關鍵詞檢索，獲取與肝炎和肝損傷相關的疾病靶點，選擇score≥3.26的靶點作為疾病靶點[13-15]。采用Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）將成分靶點和疾病靶點取交集，獲得交集靶點。將交集靶點導入String（https://string-db.org/cgi/input）數(shù)據(jù)庫[16]，獲得靶點間相互作用關系并導入Cytoscape 3.2.1軟件，構建蛋白質-蛋白質互作（PPI）網(wǎng)絡，同時計算degree值，并按＞2倍degree中位數(shù)條件篩選獲得核心靶點。采用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對靶點進行GO生物過程富集分析和KEGG通路分析[17]，并采用OmicShare云平臺進行數(shù)據(jù)可視化。最終，構建五味子藤莖保肝作用的“活性成分-核心靶點-通路”關聯(lián)網(wǎng)絡。

2.5 分子對接驗證

將上述篩選獲得的活性成分與核心靶點依次進行分子對接。首先在PubChem數(shù)據(jù)庫下載活性成分2D結構的sdf格式文件，在RCSB數(shù)據(jù)庫下載核心靶點蛋白3D結構pdb格式文件。進一步使用Autodock Tools1.5.6對蛋白和成分數(shù)據(jù)進行加氫、除水等處理并保存為pdbqt格式。采用Vina和PyMoL2.1.1軟件對活性成分和靶點蛋白進行對接打分，并以對接評分Affinity評價對接結果[18-19]。采用GraphPad Prism8.0和PyMoL2.1.1進行結果的可視化。

2.6 五味子藤莖對乙醇誘導的人正常肝細胞L-02損傷的保護作用研究

收集對數(shù)生長期L-02細胞，計數(shù)并配制成濃度為3×105個/mL的細胞懸液，接種于96孔板內，每孔加100 μL，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，加入含不同濃度（1%、2%、3%、4%、5%、6%）乙醇的完全培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)12、24、48 h后，以MTT法于510 nm采用酶標儀檢測吸光度（）值，計算細胞存活率。進一步以3%乙醇造模（除對照組），細胞接種后培養(yǎng)24 h后，隨機設立6組（對照組、模型組、陽性對照組和3個給藥組），每組6個復孔。對照組加入同體積完全培養(yǎng)基，陽性對照組加入聯(lián)苯雙酯（終質量濃度10 μg/mL），給藥組加入五味子藤莖提取物（終質量濃度25、50、100 μg/mL），培養(yǎng)24 h后以MTT法于510 nm采用酶標儀檢測值，計算細胞存活率。按相同方法接種和給藥，并按照試劑盒說明書分別測定聯(lián)苯雙酯（10 μg/mL）和五味子藤莖提取物（100 μg/mL）對細胞上清液ALT和AST活性的影響。

2.7 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 五味子藤莖化學成分的鑒定

采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術對五味子藤莖中的化學成分進行定性分析，總離子流圖見圖1。通過一級和二級質譜信息分析并結合相關文獻，從五味子藤莖樣品圖譜中共鑒定和表征出40個化學成分，主要為木脂素類、有機酸類、黃酮類和倍半萜類成分（表1）。對7種成分的二級質譜圖及其對照品進行了對比，其中五味子酯甲和五味子乙素對照品的鏡像對比圖譜見圖2。

3.2 基于網(wǎng)絡藥理學五味子藤莖保肝作用機制的預測結果

3.2.1 五味子藤莖活性成分篩選及其作用靶點預測針對上述鑒定獲得的五味子藤莖中的40個化學成分，采用TCMSP數(shù)據(jù)庫查找OB≥30%且滿足Lipinski類藥五原則的成分，結合文獻報道共篩選獲得活性成分12個（表2）。進一步采用TCMSP數(shù)據(jù)庫和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫分別查找和預測獲得成分靶點456和502個，刪除重復靶點后共得到成分靶點504個。

表1 五味子藤莖化學成分鑒定分析

Table 1 Identification and analysis of chemical constituents in SCRS

峰號tR/min誤差(×10?6)離子模式理論值檢測值離子碎片分子式化合物 10.92?3.00[M－H]?354.309 0353.037 8317, 299, 257, 153C16H18O9新綠原酸 21.30?3.20[M－H]?192.124 0191.018 7173, 110C6H8O7檸檬酸 31.605.99[M－H]?154.120 0153.019 3108C7H6O4原兒茶酸 42.603.10[M－H]?122.121 0121.031 3108C7H6O2對羥基苯甲醛 54.304.40[M－H]?290.268 1289.071 8205, 187, 159, 137, 121C15H14O6兒茶素 65.600.74[M－H]?280.316 0279.122 9217, 189C15H20O5psilostachyin A 76.41?1.80[M－H]?168.147 0167.035 0149, 131C8H8O4香草酸 86.798.74[M－H]?462.404 0461.111 2416, 254C22H22O11異山梨醇 97.493.22[M－H]?264.317 0263.128 6245, 201, 174C15H20O4脫落酸 109.801.20[M－H]?228.371 0227.201 7209, 191, 146C14H28O2myristic acid 1112.304.90[M－H]?270.236 9269.045 8252, 224, 169C15H10O5芹菜素 1226.060.70[M－H]?470.684 0469.346 7451, 433, 405, 377C30H46O4nigranoic acid 131.43?1.26[M＋H]+126.045 5127.038 898, 82C6H6O33-羥甲基-2-糠醛 145.690.16[M＋H]+610.518 0611.160 7593, 578, 550, 507, 478, 458C27H30O16蘆丁 155.92?0.49[M＋H]+302.236 0303.049 7285, 270C15H10O7槲皮素 166.81?0.93[M＋H]+196.286 0197.153 4179, 161, 146, 131C12H20O2neryl acetate 1710.200.45[M＋H]+418.480 0419.206 6369, 324, 295C23H30O7戈米辛S/T 1810.20?1.00[M＋H]+418.199 0419.206 6401, 386, 370, 355C23H30O7henricine A 1912.740.77[M＋H]+326.386 0327.159 3283, 203, 188, 171C20H22O4里卡靈A 2012.960.52[M＋H]+416.464 0417.196 7399, 385, 357, 314, 285, 265C23H28O7五味子醇乙* 2112.96?0.80[M＋H]+390.500 0391.211 3327, 257C22H30O6前戈米辛 2213.10?4.80[M＋H]+388.454 0389.194 0357, 325, 301C22H28O6戈米辛J 2313.450.07[M＋H]+530.564 0531.222 5485, 401, 383, 353, 341C28H34O10戈米辛D 2413.451.40[M＋H]+530.607 0531.222 5501, 483, 437C29H38O9當歸酰戈米辛Q 2513.960.51[M＋H]+416.184 0433.222 3415, 400, 384, 369, 338C24H32O7五味子醇甲* 2614.73?3.46[M＋H]+500.588 0501.246 5483, 452, 437, 427, 414C28H36O8巴豆酰戈米辛H 2714.74?0.12[M＋H]+498.565 0499.232 5481, 463, 439, 421, 403C28H34O8當歸酰(異)戈米辛O 2814.80?4.71[M＋H]+522.594 0523.230 1508, 493, 409, 393C30H34O8苯甲酰戈米辛H 2915.080.81[M＋H]+432.154 0431.206 7400, 372, 356C24H30O7schinsanlignone A 3015.28?3.80[M＋H]+536.570 0537.209 8519, 476, 406C30H32O9五味子酯甲* 3116.000.72[M＋H]+386.438 0387.180 2372, 355, 325, 285C22H26O6戈米辛R 3216.020.72[M＋H]+386.444 0387.180 2372, 355, 324, 285C22H26O6戈米辛M2* 3316.81?0.49[M＋H]+524.688 0525.321 1407, 489, 465, 447C32H44O6schisanbilactone A 3417.070.73[M＋H]+416.510 0417.227 4402, 371, 315C24H32O6五味子甲素* 3517.32?1.09[M＋H]+204.351 1205.194 8149, 135, 107C15H24calarene 3617.582.14[M＋H]+400.464 8401.196 7386, 370, 300, 285, 269C23H28O6五味子乙素* 3717.582.14[M＋H]+400.189 0401.196 7383, 368, 354C23H28O6γ-五味子醇甲 3817.80?4.94[M＋H]+520.570 0521.214 4421, 399, 368, 353, 337C30H32O8苯甲酰戈米辛O 3917.81?3.80[M＋H]+384.422 0385.164 6355, 285, 257, 242, 212C22H24O6五味子丙素* 4019.02?0.28[M＋H]+470.684 0471.346 7453, 435, 417C30H46O4kadsuric acid

*對照品比對的化合物

*compounds aligned against controls

3.2.2 疾病靶點的獲得 在OMIM、GeneCards和KEGG等3個數(shù)據(jù)庫中，以“hepatitis”與“hepatic injury”為關鍵詞檢索疾病靶點，選擇score≥3.26的靶點作為潛在疾病靶點。合并3個數(shù)據(jù)庫的結果，并刪除重復項后得到1037個靶點。采用Venny 2.1.0在線平臺將成分靶點與疾病靶點取交集，獲得交集靶點118個，作為五味子藤莖保肝作用的潛在靶點（圖3）。

表2 五味子藤莖有效成分信息

Table 2 Information of effective components of SCRS

編號化合物CAS號分子式 1五味子甲素61281-38-7C24H32O6 2五味子乙素69176-52-9C23H28O6 3五味子丙素61301-33-5C22H24O6 4五味子醇乙58546-54-6C23H28O7 5五味子酯甲58546-56-8C30H32O9 6當歸酰（異）戈米辛O83864-70-4C28H34O8 7戈米辛M282425-45-4C22H26O6 8戈米辛R82467-50-3C22H26O6 9里卡靈A51020-86-1C20H22O4 10南五味子酸62393-88-8C30H46O4 11肉豆蔻酸544-63-8C14H28O2 12槲皮素117-39-5C15H10O7

圖3 成分靶點與疾病靶點韋恩圖

3.2.3 PPI網(wǎng)絡的構建及核心靶點篩選 將交集靶點導入String11.5數(shù)據(jù)庫，獲得靶點間相互作用關系，保存為TSV文件。進一步將數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.2.1軟件，構建PPI網(wǎng)絡（圖4）并篩選獲得大于2倍degree值的核心靶點16個，包括腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α（phosphatidylinositol-3-kinase catalytic subunit alpha isoform，PIK3CA）、人半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartic protease-3，Caspase 3）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT（serine/threonine- protein kinase AKT，AKT1）、信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（proto- oncogene tyrosine-protein kinase，SRC）等。

3.2.4 富集分析及“成分靶標通路功能”網(wǎng)絡的構建 采用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫對五味子藤莖保肝的16個核心靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路分析。根據(jù)FDR≤0.05篩選共獲得了317個GO條目，包括226個生物學過程（bioprogress，BP）條目，29個細胞組分（cell components，CC）條目和62個分子功能（molicular function，MF）條目，取前20個條目上傳至OmicShare 云平臺進行可視化，結果見圖5-A。結果表明，上述核心靶點參與的生物學過程主要包括：信號轉導（signal transduction）、對RNA聚合酶II啟動子的轉錄正調節(jié)（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）等。KEGG富集分析共獲得FDR≤0.05的通路120條，取前20條最顯著的通路進行可視化分析，結果見圖5-B。結果表明，與五味子藤莖保肝作用密切相關的信號通路主要包括PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路（VEGF signaling pathway）、FoxO信號通路（FoxO signaling pathway）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）等。進一步構建了五味子藤莖保肝作用的“活性成分-靶基因-通路”網(wǎng)絡，結果見圖6。

圖4 交集靶點的PPI網(wǎng)絡

圖5 GO (A) 和KEGG (B) 富集分析結果

3.3 分子對接驗證

將篩選出的16個核心靶點與12個活性成分依次進行分子對接。對接結果（圖7）顯示，大于?4.25 kJ/mol的結果占總數(shù)的94%，?4.25～?7.00 kJ/mol的結果占總數(shù)的49%，大于?7.00 kJ/mol的結果占總數(shù)的45%，所有活性成分（除肉豆蔻酸外）均大于?4 kJ/mol。各成分（除肉豆蔻酸外）與EGFR、PIK3CA、CASP3、RXRA和TNF均具有良好的結合活性，其中五味子酯甲、五味子甲素、五味子丙素、五味子乙素、槲皮素、戈米辛M2和戈米辛R顯示出強烈結合活性。五味子甲素可與EGFR、PIK3CA和MAPK3發(fā)生相互作用，又以與PIK3CA結合活性最好，主要作用于其殘基苯丙氨酸（Phe）930、酪氨酸（Tyr）936、異亮氨酸（Ile）932和天冬氨酸（Asp）933。戈米辛M2可與EGFR和TNF等發(fā)生相互作用，與TNF結合時，作用于其殘基谷氨酰胺（Gln）102和絲氨酸（Ser）99。五味子丙素與PIK3CA結合時，作用于其殘基天冬氨酸（Asn）677、賴氨酸（Lys）678、蘇氨酸（Thr）471和絲氨酸（Ser）474。五味子乙素與RXRA結合時，作用于其殘基Lys232和Ile236。五味子酯甲與MAK3結合時，作用于其殘基精氨酸（Arg）41、纈氨酸（Val）205和半胱氨酸（Cys）42。槲皮素與PIK3CA結合時，作用于其殘基甘氨酸（Gly）1007、Ser1008和脯氨酸（Pro）447（圖8）。

三角形-活性成分 橢圓形-核心靶點 長方形-信號通路

圖7 分子對接分數(shù)的熱圖分析

3.4 五味子藤莖對乙醇誘導的人正常肝細胞L-02損傷的保護作用

不同濃度的乙醇作用L-02細胞后，隨著時間的延長，細胞存活率逐漸降低，呈現(xiàn)時間和劑量相關性（圖9-A）。而50、100 μg/mL的五味子藤莖乙醇提取物作用24 h可顯著升高細胞存活率（＜0.05，0.01），見圖9-B。與空白對照組相比，模型組ALT和AST顯著升高（＜0.01），而100 μg/mL的五味子藤莖乙醇提取物作用24 h可顯著降低乙醇引起的ALT和AST的升高，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義（＜0.01）。

圖8 部分活性成分與靶點分子對接模式

4 討論

五味子種植過程中每年修剪掉大量的藤莖，這部分資源尚未被合理開發(fā)利用。本研究系統(tǒng)分析五味子藤莖的主要成分，并結合網(wǎng)絡藥理學和分子對接方法預測保肝藥效物質和潛在的作用靶點及通路，為五味子藤莖的開發(fā)利用提供依據(jù)。研究表明，五味子藤莖提取物可顯著降低小鼠血清中ALT、AST水平，對CCl4致肝損傷小鼠發(fā)揮保護作用[20]。本研究也證實五味子藤莖提取物對酒精致?lián)p傷的L-02細胞模型具有一定的保護作用，且可顯著降低ALT、AST活性，說明其抗肝損傷作用是明確的。在此基礎上，本實驗采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術共從五味子藤莖乙醇提取物種中鑒定40個化學成分。根據(jù)OB值≥30%及類藥五原則標準，最終篩選獲得12種活性成分，其中有9個為木脂素類成分，表明木脂素可能是五味子藤莖防治肝病的主要藥效物質。

近年來，網(wǎng)絡藥理學在中藥及復方有效成分篩選、靶點及通路的預測方面得到了廣泛應用，減少了研究的盲目性、提高了藥物發(fā)現(xiàn)的效率[21-22]。分子對接技術則通過將成分與靶點蛋白相結合，以虛擬評價的方式驗證網(wǎng)絡藥理學的預測結果[23]。本研究進一步采用網(wǎng)絡藥理學方法對篩選獲得的五味子藤莖活性物質保肝作用的潛在靶點及通路進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)上述12個活性成分主要作用于STAT3、EGFR、AKT1、TNF、PIK3CA、CASP3、MAPK8等16個核心靶點。分子對接結果發(fā)現(xiàn)，除肉豆蔻酸外，其余11種成分均與EGFR、PIK3CA、CASP3、MAPK3、TNF 5種核心靶點蛋白具有強烈的結合活性（結合能＞?4 kJ/mol）。

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

通過“活性成分-靶基因-通路”網(wǎng)絡分析，PI3K-Akt、VEGF、FoxO、HIF-1等信號通路是五味子藤莖活性成分保肝作用的主要通路。研究顯示，PI3K-Akt信號通路與肝炎、肝損傷有關[24]。而五味子酯甲能通過抑制膠質細胞內MAPKs和PI3K/Akt通路參與介導的炎癥反應[25-26]。VEGF信號通路和HIF-1信號通路參與肝纖維化過程[27]。五味子乙素則可通過下調VEGF信號通路血管新生因子VEGF-A、EGF和bFGF的表達，誘導肝癌細胞HCCLM3的凋亡[28]。FoxO信號通路中FoxO1通過增加脂聯(lián)素受體2和微粒體甘油三酯轉運蛋白的表達，從而抑制酒精性肝損傷的惡化，而五味子甲素對Akt/FoxO信號通路具有一定的影響[29-30]。此外，KEGG通路富集結果中顯示，肝損傷涉及的通路還包括TNF、NF-κB、STAT3/Akt/MAPK等信號通路。研究表明，五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙均可通過NF-κB信號通路抑制細胞色素P4502E1誘導的氧化應激，減輕肝損傷。五味子酯甲則通過抑制TAK1/MAPK和NF-κB信號通路相關蛋白表達改善肝纖維化[31]。此外，五味子醇乙主要通過調控STAT3/Akt/MAPK信號通路下調炎癥因子白介素-6表達起到保肝作用[32]。

綜上，本研究首次采用UPLC-Q-TOF-MS/MS結合網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術明確了五味子藤莖保肝作用的藥效物質基礎、潛在作用靶點及通路，為合理利用五味子藤莖資源研發(fā)具有保肝作用的大健康產(chǎn)品提供了科學依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Potential pharmacodynamic substances and mechanism ofrattan stems in liver protection based on UPLC-Q-TOF-MS/MS and network pharmacology

QU Zhong-yuan1, LUO Long-tan1, ZHANG Wen-jun1, HU Yang1, YANG Xiao-long1, BING Yi-fan1, WANG Qi-xuan1, LI Wen-lan1, 2, ZOU Xiang2, 3

1.Teaching and Research Department of Chinese Pharmacy, College of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China 2. Pharmaceutical Engineering Technology Research Center, College of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China 3. Harbin Yuzhou Rentai Pharmaceutical Engineering Research Center Co., Ltd., Harbin 150076, China

To analyze the main components ofrattan stems (SCRS) by ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS/MS), and predict the hepatoprotective substances and potential targets and signaling pathways by network pharmacology and molecular docking.According to the fragmentation of secondary mass spectrometry and literature data, the chemical constituents of SCRS were analyzed and identified. The active components with OB ≥ 30% in accordance with the five principles of drugs were screened through the TCMSP database. The potential targets of active components of SCRS were checked in TCMSP database and predicted by SwissTargetPrediction online platform. The “hepatitis” and “l(fā)iver injury” were selected as key words to screen disease targets with OMIM, GeneCards and KEGG databases. PPI network was constructed using String11.5 database and Cytoscape 3.7.2 software, and core targets were screened. DAVID 6.8 database was used for gene ontology (GO) anotation and KEGG pathway enrichment analysis. AutoDockTools 1.5.6 software was used to verify the molecular docking between the active components and the key targets of SCRS. Themodel of liver cell injury was established and the protective effect of SCRS extract on liver cell injury was investigated.A total of 40 main components were identified in SCRS, including lignans, flavonoids, organic acids and so on. 12 active ingredients were further screened, and 118 intersection targets of active ingredients and diseases were obtained. Sixteen core targets were obtained by network topology screening. Enrichment analysis showed that the main pathways involved in the hepatoprotective effect of SCRS included TNF, hepatitis C, hepatitis B and VEGF signaling pathways. The results of molecular docking showed that ingredients such as schisandrin A, schisandrin B, schisandrin C, schisantherin A, quercetin, gomixin M2 and gomixin R could interact with targets including EGFR, PIK3CA, TNF, Caspase-3 and other proteins with good binding affinity. SCRS could suppress the decrease of L-02 cell survival rate and inhibit ALT and AST activity induced by alcohol.SCRS shows a good hepatoprotective effect, and the main medicinal substance is lignans, which can exert hepatoprotective effect through multi-target and multi-pathway.

rattan stems; liver protection; active ingredients; network pharmacology; molecular docking; schisandrin A; schisandrin B; schisandrin C; schisantherin A; quercetin; gomixin M2; gomixin R

R284.1；R285

A

0253 - 2670(2022)08 - 2407 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.018

2022-01-18

黑龍江省重點研發(fā)計劃指導類項目（GZ20210110）；黑龍江省博士后科研啟動金資助項目（LBH-Q16133）；哈爾濱商業(yè)大學青年創(chuàng)新人才支持計劃項目（2020CX11）；哈爾濱市科技攻關計劃項目（2012DB3BS057）

曲中原（1980—），女，博士，教授，博士生導師，從事中藥藥效物質基礎及中藥炮制研究。

鄒 翔（1978—），男，博士，研究員，博士生導師，Tel: (0451)84839434 E-mail: zou8663202@163.com

[責任編輯 王文倩]