陳 琦，張亞云，張丹丹，夏 楊，孫 麗，曹思瑤，卞慧敏*

小兒廣樸止瀉口服液治療腹瀉機(jī)制的預(yù)測及初步驗(yàn)證

陳 琦1，張亞云2，張丹丹2，夏 楊2，孫 麗3，曹思瑤3，卞慧敏1*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023 2. 雷允上藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 蘇州 215009 3. 長春雷允上藥業(yè)有限公司，吉林 長春 132000

通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測和分子對接技術(shù)探究小兒廣樸止瀉口服液治療腹瀉的活性成分和作用機(jī)制，并在大鼠小腸上皮IEC-6細(xì)胞上進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)（TCMSP）數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)檢索獲取小兒廣樸止瀉口服液的化學(xué)成分；采用GeneCards和DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲得腹瀉相關(guān)基因，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction network，PPI）網(wǎng)絡(luò)獲得小兒廣樸止瀉口服液治療腹瀉的重要靶點(diǎn)，并進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；使用Autodock Vina軟件進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞損傷模型，采用MTT、ELISA法檢測小兒廣樸止瀉口服液對細(xì)胞凋亡及炎癥的影響，并通過Western blotting法驗(yàn)證其可能的作用機(jī)制。小兒廣樸止瀉口服液的主要活性成分有63個(gè)，預(yù)測獲得重要靶點(diǎn)86個(gè)，核心靶點(diǎn)28個(gè)；GO功能和KEGG通路富集分析顯示小兒廣樸止瀉口服液主要調(diào)控了機(jī)體炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等生物過程，涉及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）以及磷酸肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3- kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）等信號(hào)通路。體外結(jié)果表明小兒廣樸止瀉口服液能顯著升高LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞存活率（＜0.01），顯著抑制炎癥因子白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β和TNF-α的分泌（＜0.01），顯著下調(diào)剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）、Caspase-8、核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）蛋白表達(dá)（＜0.01），上調(diào)β-catenin蛋白表達(dá)（＜0.01）。小兒廣樸止瀉口服液可能通過抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡治療腹瀉。

小兒廣樸止瀉口服液；腹瀉；IEC-6細(xì)胞；抗炎；凋亡；分子對接；啤酒甾醇；蘆丁

小兒腹瀉是一種由多病原及多因素引起的兒科消化道多發(fā)病和常見病[1]，是全球范圍內(nèi)引起5歲內(nèi)兒童死亡的第2大原因[2]。目前臨床多采用抗生素對癥治療急性腹瀉，對于慢性腹瀉尚無特效藥物，而長期服用抗生素易引起耐藥性、便秘、惡心、腸道菌群紊亂等不良反應(yīng)[3-4]。中醫(yī)無“腹瀉”之病名，可將其歸屬于“泄瀉”范疇[5]，中醫(yī)認(rèn)為引起小兒腹瀉的常見病因包括感受外邪、內(nèi)傷乳食、脾胃虛弱或脾腎陽虛，病位在脾胃[6]，脾胃運(yùn)化失常，清濁相干，并走大腸。臨床主要從“健脾運(yùn)脾”和“淡滲利濕”2個(gè)方面入手治療小兒泄瀉，并取得了較好的療效。小兒廣樸止瀉口服液源于我國著名中醫(yī)兒科專家倪珠英教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方，主要由廣藿香、蒼術(shù)、茯苓、澤瀉、厚樸、車前草、陳皮以及六神曲8味中藥組成。小兒廣樸止瀉口服液臨床用于治療小兒感染性腹瀉和非感染性腹瀉的療效良好，然而其作用機(jī)制卻不明確。因此本研究借助于數(shù)據(jù)庫和分子對接技術(shù)預(yù)測小兒廣樸止瀉口服液治療腹瀉的有效成分及可能的作用靶點(diǎn)，并在大鼠小腸上皮IEC-6細(xì)胞上進(jìn)行了初步的驗(yàn)證，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞

IEC-6細(xì)胞購自北京協(xié)和細(xì)胞庫。

1.2 藥品與試劑

小兒廣樸止瀉口服液（批號(hào)014211002）由長春雷允上藥業(yè)有限公司提供；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，批號(hào)0000081277）購自美國Sigma公司；MTT粉末（批號(hào)20190105）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）抗體（批號(hào)00096469）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Caspase-8抗體（批號(hào)40044）購自美國GeneTex公司；核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）抗體（批號(hào)GR226290-5）、β-catenin抗體購自英國Abcam公司；β-actin抗體（批號(hào)ATUMA0501）購自翼飛雪生物科技公司；HRP標(biāo)記的二抗（批號(hào)ATUJA0801）購自武漢Abbkine生物技術(shù)有限公司；白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號(hào)20211020）、IL-1β ELISA試劑盒（批號(hào)20211020）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號(hào)20211020）購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器

Universal hood II型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；Nanodrop分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Synergy2多功能酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司）。

2 方法

2.1 活性成分和藥物靶點(diǎn)的收集

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)（TCMSP）和文獻(xiàn)報(bào)道搜索小兒廣樸止瀉口服液（廣藿香、蒼術(shù)、茯苓、澤瀉、厚樸、車前草、陳皮、六神曲）的活性成分，根據(jù)藥物藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行篩選，納入口服生物利用度≥30%且類藥性≥0.18的活性成分[7]，同時(shí)將《中國藥典》2020年版收載的指標(biāo)性成分重新納入。記錄活性成分PubChem ID、靶點(diǎn)名稱，通過Sting平臺(tái)轉(zhuǎn)換靶點(diǎn)蛋白名稱為基因名稱，通過PubChem數(shù)據(jù)庫搜索文獻(xiàn)報(bào)道的靶點(diǎn)，合并所有的藥物靶點(diǎn)用于后續(xù)研究。

2.2 腹瀉疾病靶點(diǎn)預(yù)測

通過人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards）和DisGeNET數(shù)據(jù)庫檢索腹瀉疾病基因。在Genecards數(shù)據(jù)庫中選擇關(guān)聯(lián)分?jǐn)?shù)＞20的基因[8]，在DisGeNET數(shù)據(jù)庫中選擇證據(jù)指數(shù)（evidence index，EI）＝1、疾病特異性指數(shù)（dysphonia severity index，DSI）＜0.5、疾病多效性指數(shù)（disease pleiotropy index，DPI）＞0.5、score≥0.01的基因，2個(gè)數(shù)據(jù)庫得到的基因合并去重后獲得腹瀉相關(guān)基因。隨后與藥物靶點(diǎn)取交集，并繪制韋恩圖，提取的交集靶點(diǎn)即為小兒廣樸止瀉口服液治療腹瀉的潛在靶點(diǎn)。

2.3 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與拓?fù)浞治?/h3>

將化合物、交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件生成化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，對該網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的多個(gè)拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析，計(jì)算每個(gè)節(jié)點(diǎn)的度中心性、中間中心度、緊密中心性以及拓?fù)湎禂?shù)。度中心性值大于度中心性值中位數(shù)2倍的節(jié)點(diǎn)稱為重要節(jié)點(diǎn)，其他指標(biāo)大于所有節(jié)點(diǎn)的中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)稱為核心靶點(diǎn)[9]，篩選出小兒廣樸止瀉口服液發(fā)揮治療作用的核心化合物和核心靶點(diǎn)。

2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction network，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將小兒廣樸止瀉口服液治療腹瀉的潛在靶點(diǎn)上傳String平臺(tái)[10]，選擇high confidence為0.7，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)信息文件，計(jì)算每個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值，篩選度值＞平均度值的靶點(diǎn)作為小兒廣樸止瀉口服液治療腹瀉的重要靶點(diǎn)[11]。

2.5 基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

將PPI網(wǎng)絡(luò)得到的重要靶點(diǎn)導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫[12]，進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析，將≤0.01作為通路聚類標(biāo)準(zhǔn)，篩選出顯著生物功能和信號(hào)通路。

2.6 分子對接驗(yàn)證

使用Autodock Vina 1.1.2軟件進(jìn)行小分子與蛋白對接[13]。

2.7 體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.7.1 藥物配制 以小兒廣樸止瀉口服液作為原液（濃度視為100%），使用前用培養(yǎng)基稀釋成終濃度進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)。

2.7.2 細(xì)胞培養(yǎng) IEC-6細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度為70%時(shí)，用0.25%胰酶消化進(jìn)行傳代，取處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.7.3 MTT檢測IEC-6細(xì)胞活力 IEC-6細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后以1×105/mL接種于96孔板中，設(shè)置對照組、模型組和不同濃度小兒廣樸止瀉口服液（3.24%、1.08%、0.36%、0.12%、0.04%）組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，模型組和各給藥組加入10 nmol/L LPS，各給藥組再加入不同濃度的小兒廣樸止瀉口服液，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。加入MTT溶液（5 g/L），孵育4 h后加入二甲基亞砜，采用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝1－(對照－給藥)/對照

2.7.4 ELISA檢測IEC-6細(xì)胞上清液中炎癥因子水平 EC-6細(xì)胞以1×105/mL接種于96孔板中，設(shè)置對照組、模型組和小兒廣樸止瀉口服液（0.04%、0.12%、0.36%）組，模型組和各給藥組加入10 nmol/L LPS，各給藥組再加入不同濃度的小兒廣樸止瀉口服液，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞上清液，3000 r/min離心15 min，取上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測IL-1β、TNF-α和IL-6水平。

2.7.5 Western blotting檢測IEC-6細(xì)胞cleaved Caspase-3、Caspase-8、NF-κB p65和β-catemin蛋白表達(dá)情況 按“2.7.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和處理，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解過夜，次日離心取上清液檢測蛋白濃度后煮沸。取30 μg總蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜；次日TBST緩沖液洗膜后，加入二抗，室溫孵育2 h，TBST緩沖液清洗后進(jìn)行曝光，以灰度值進(jìn)行定量分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 小兒廣樸止瀉口服液的主要活性成分和潛在治療靶點(diǎn)

在通過TCMSP檢索和文獻(xiàn)查詢后，根據(jù)口服生物利用度≥30%且類藥性≥0.18，得到小兒廣樸止瀉口服液主要活性成分63個(gè)。通過TCMSP、PubChem等數(shù)據(jù)庫檢索到63個(gè)活性成分的664個(gè)藥物靶點(diǎn)；同時(shí)通過GeneCards和DisGeNET數(shù)據(jù)庫檢索到腹瀉相關(guān)疾病基因1025個(gè)。將藥物靶點(diǎn)與疾病基因進(jìn)行交集，得到277個(gè)小兒廣樸止瀉口服液治療腹瀉的潛在作用靶點(diǎn)。

3.2 小兒廣樸止瀉口服液化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)浞治?/h3>

對277個(gè)潛在靶點(diǎn)構(gòu)建小兒廣樸止瀉口服液化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（圖1-A），結(jié)果顯示共有28個(gè)小兒廣樸止瀉口服液治療腹瀉的重要靶點(diǎn)。同時(shí)，通過對網(wǎng)絡(luò)中代表活性成分的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析，挖掘出小兒廣樸止瀉口服液中相對重要的活性成分有15個(gè)，所有節(jié)點(diǎn)分布情況見圖1-B。

3.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

在String數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建上述277個(gè)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)見圖2。篩選度值＞平均度值的靶點(diǎn)作為重要靶點(diǎn)，獲得86個(gè)重要靶點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)排名前20的重要靶點(diǎn)類別可分為蛋白激酶、細(xì)胞因子、趨化因子、受體以及配體等，主要與機(jī)體炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長、細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及機(jī)體代謝等過程相關(guān)。在PPI網(wǎng)路中，大于平均度值且排名前5的靶點(diǎn)依次為蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT1）、白蛋白（albumin，ALB）、內(nèi)皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、內(nèi)皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和IL-8/CXCL8。

3.4 KEGG信號(hào)篩選與GO生物過程富集結(jié)果

對86個(gè)重要靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，其中生物過程富集有273條，細(xì)胞組分富集28條，分子功能有38條。GO分析分別取以上3個(gè)部分的顯著前20條目錄進(jìn)行條形圖展示，見圖3。對86個(gè)重要靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集，排名前20的信號(hào)通路見圖4。結(jié)果顯示重要靶點(diǎn)顯著富集于炎癥、癌癥、免疫調(diào)節(jié)、傳染病等相關(guān)信號(hào)通路，其中TNF、Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）以及磷酸肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-Akt信號(hào)通路的富集程度高。因此，小兒廣樸止瀉口服液可能通過以上通路調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥免疫反應(yīng)及腸黏膜損傷修復(fù)，從而治療腹瀉。

圖1 小兒廣樸止瀉口服液化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(A) 及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D(B)

圖2 小兒廣樸止瀉口服液治療腹瀉潛在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

3.5 核心化合物-核心靶點(diǎn)分子對接驗(yàn)證

對化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)篩選出的28個(gè)核心靶點(diǎn)與PPI網(wǎng)絡(luò)得到的前20個(gè)重要靶點(diǎn)取交集，得到4個(gè)主要的核心靶點(diǎn)：絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1，CCND1）、CXCL8及編碼β-catenin蛋白的基因CTNNB1。對化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)篩選出的度值＞10的8個(gè)核心化合物（obovatol、cerevisterol、rutin、honokiol、alisol C monoacetate、magnolol、irisolidone、alisol B）和4個(gè)主要核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，經(jīng)Autodock Vina 1.1.2軟件對接后獲得各化合物與靶點(diǎn)對接的結(jié)合能，經(jīng)換算后見表1。隨后采用Pymol軟件對產(chǎn)生強(qiáng)烈結(jié)合的化合物和靶點(diǎn)的對接位點(diǎn)進(jìn)行可視化處理，見圖5。結(jié)果顯示8個(gè)核心化合物與4個(gè)主要的核心靶點(diǎn)均有較好的結(jié)合活性，其中大部分化合物與MAPK1、CCND1及CXCL8均能產(chǎn)生強(qiáng)烈的結(jié)合，而啤酒甾醇和蘆丁與該4個(gè)主要核心靶點(diǎn)均能產(chǎn)生強(qiáng)烈結(jié)合。提示MAPK1、CCND1、CXCL8及CTNNB1可能是小兒廣樸止瀉口服液治療腹瀉的主要直接作用靶點(diǎn)，而啤酒甾醇和蘆丁可能是發(fā)揮作用的核心化合物。

圖3 小兒廣樸止瀉口服液治療腹瀉靶點(diǎn)的GO功能富集分析

圖4 小兒廣樸止瀉口服液治療腹瀉靶點(diǎn)的KEGG通路富集氣泡圖

表1 小兒廣樸止瀉口服液中核心化合物與主要核心靶點(diǎn)的結(jié)合能

Table 1 Binding energy of core compounds and main core targets of Xiaoer Guangpu Zhixie Oral Liquid

來源化合物中文名與靶點(diǎn)的結(jié)合能/(kJ·mol?1) MAPK1CCND1CXCL8CTNNB1 厚樸obovatol厚樸新酚?30.14?28.46?27.21?28.05 茯苓cerevisterol啤酒甾醇?36.84?30.14?32.23?32.23 六神曲rutin蘆丁?38.51?34.74?33.49?36.42 厚樸honokiol和厚樸酚?32.65?30.14?28.46?30.56 澤瀉alisol C monoacetate23-乙酰澤瀉醇C?28.88?29.30?32.65?32.23 厚樸magnolol厚樸酚?31.39?28.88?28.88?29.30 廣藿香irisolidone尼泊爾鳶尾異黃酮?32.65?29.72?28.46?31.81 澤瀉alisol B澤瀉醇B?30.56?30.98?28.88?29.72

圖5 小兒廣樸止瀉口服液核心化合物與核心靶點(diǎn)的分子對接模型及位點(diǎn)

3.6 小兒廣樸止瀉口服液對LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞存活率的影響

如圖6所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞存活率均顯著升高（＜0.01），且0.04%～0.36%小兒廣樸止瀉口服液呈劑量相關(guān)性。

3.7 小兒廣樸止瀉口服液對LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞上清液中炎癥因子水平的影響

如圖7所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著降低（＜0.01），且呈劑量相關(guān)性，提示小兒廣樸止瀉口服液能減輕LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01，下圖同

圖7 小兒廣樸止瀉口服液對LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞上清液中炎癥因子水平的影響(, n = 3)

3.8 小兒廣樸止瀉口服液對LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞炎癥及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步闡明小兒廣樸止瀉口服液抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的機(jī)制，檢測了炎癥及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，如圖8所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞炎癥信號(hào)核內(nèi)蛋白NF-κB p65以及促凋亡蛋白cleaved Caspase-3、Caspase-8表達(dá)均顯著升高（＜0.01），β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞cleaved Caspase-3、Caspase-8及核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01），β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）。

圖8 小兒廣樸止瀉口服液對LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞炎癥及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

中醫(yī)將腹瀉歸屬于“泄瀉”范疇，《幼幼集成》載：“夫泄瀉之本，無不由于脾胃”，認(rèn)為“腹瀉”的基本病機(jī)為脾虛濕盛，因此治療則以化濕運(yùn)脾為主要原則。小兒廣樸止瀉口服液中廣藿香有芳香化濁、開胃止吐、發(fā)表解暑的功效；蒼術(shù)可健脾解郁、燥濕辟穢，二者共為君藥，為祛濕之要藥；茯苓、厚樸、澤瀉為臣藥，其中茯苓、澤瀉均可利水滲濕；厚樸可燥濕消痰、下氣除滿；車前草清熱解毒，可治暑濕瀉?。涣袂上辰∥?、和中止瀉，二者共為佐藥；輔以陳皮理氣和胃、燥濕醒脾。全方共奏祛濕止瀉、和中運(yùn)脾之功效，契合腹瀉的中醫(yī)癥候。臨床用于治療濕困脾土所致的小兒泄瀉，癥見泄瀉、大便稀溏或水樣、腹脹、腹痛、納差、嘔吐、或見發(fā)熱、舌淡苔白膩以及輪狀病毒性腸炎和非感染性腹瀉等癥。前期藥理學(xué)研究亦表明小兒廣樸止瀉口服液能抑制和殺滅輪狀病毒，具有解痙、促進(jìn)胃液分泌、抗炎和增強(qiáng)免疫力的作用[14]，且富含鉀、鈉、鎂、鋅等人體微量元素，對腹瀉引起的脫水、電解質(zhì)失衡有調(diào)節(jié)作用。然而其作用機(jī)制尚不清晰，本研究擬從藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)闡明小兒廣樸止瀉口服液治療腹瀉的作用及機(jī)制。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明腹瀉發(fā)病機(jī)制涉及腸道炎癥、胃腸激素分泌紊亂和腸黏膜損傷等因素。本研究預(yù)測得到小兒廣樸止瀉口服液調(diào)控的84個(gè)重要靶點(diǎn)主要參與了炎癥免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等生物進(jìn)程，調(diào)節(jié)了TNF、TLR、HIF-1以及PI3K-Akt等信號(hào)通路，其中主要的核心靶點(diǎn)為MAPK1、CCND1、CXCL8和CTNNB1。TNF在炎癥、細(xì)胞增殖和凋亡中具有重要作用，TNF-α可作為細(xì)菌感染急性期的炎性指標(biāo)[15]。TLR信號(hào)通路中的TLRs激活后，可通過NF-κB、MAPK等信號(hào)通路來調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放，在炎癥調(diào)控、免疫細(xì)胞增殖等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[16]。MAPK1家族是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，p38 MAPK能使NF-κB表達(dá)和活化，加劇炎癥性腸病患者的腸道炎癥[17]。CTNND1表達(dá)β-catenin蛋白，是調(diào)控結(jié)腸上皮干細(xì)胞增殖和分化的重要組織者[18]。結(jié)合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證實(shí)了小兒廣樸止瀉口服液具有抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的作用，初步探討了小兒廣樸止瀉口服液治療腹瀉的機(jī)制，在一定程度上驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選的結(jié)果。

綜上所述，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[19]和分子對接技術(shù)初步預(yù)測了小兒廣樸止瀉口服液治療腹瀉的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及潛在作用機(jī)制，同時(shí)通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測，表明小兒廣樸止瀉口服液可通過多組分-多靶點(diǎn)-多通路抑制腸道炎癥，調(diào)節(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的凋亡和增殖，拮抗腸道黏膜損傷，從而發(fā)揮治療腹瀉的作用，為后續(xù)深入探究藥物機(jī)制、推廣臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Prediction and preliminary verification of mechanism of Xiaoer Guangpu Zhixie Oral Liquid in treatment of diarrhea

CHEN Qi1, ZHANG Ya-yun2, ZHANG Dan-dan2, XIA Yang2, SUN Li3, CAO Si-yao3, BIAN Hui-min1

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Leiyunshang Pharmaceutical Group Co., Ltd., Suzhou 215009, China 3. Changchun Leiyunshang Pharmaceutical Co., Ltd., Changchun 132000, China

To explore the active ingredients and mechanism of Xiaoer Guangpu Zhixie Oral Liquid (小兒廣樸止瀉口服液) in treatment of diarrhea by database prediction and molecular docking, and preliminarily verify it on rat intestinal epithelium IEC-6 cells.TCMSP database and literature retrieval were applied to obtain chemical components of Xiaoer Guangpu Zhixie Oral Liquid. Disease targets relating to diarrhea were screened out through GeneCards and DisGeNET database. A protein-protein interaction (PPI) network was constructed, and core targets in network were predicted. Gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis of core targets were performed. Furthermore, molecular docking method was used to verify the binding of components with core targets by Autodock Vina. The injury model of IEC-6 cells was induced by lipopolysaccharide (LPS), effects of Xiaoer Guangpu Zhixie Oral Liquid on apoptosis and inflammation were detected by MTT and ELISA, and possible mechanism was verified by Western blotting.There were 63 major active compounds in Xiaoer Guangpu Zhixie Oral Liquid, with 86 significant targets and 28 core targets. The results of GO function and KEGG pathway enrichment analysis revealed Xiaoer Guangpu Zhixie Oral Liquid mainly regulated the organism’s inflammatory response, cell proliferation, apoptosis and other biological processes. The mainly involved signal pathways included tumor necrosis factor (TNF) signaling pathway, Toll-like receptor (TLR) signaling pathway, hypoxia inducible factor-1 (HIF-1) signaling pathway and phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)-protein kinase B (Akt) signaling pathway.experiment confirmed that Xiaoer Guangpu Zhixie Oral Liquid could significantly increase the survival rate of IEC-6 cells induced by LPS (< 0.01), inhibit the release of inflammatory factors IL-6, IL-1β and TNF-α (< 0.01), down-regulate cleaved cystein-asparate protease-3 (cleaved Caspase-3), Caspase-8 and nuclear factor-κB p65 (NF-κB p65) protein expressions (< 0.01), and up-regulate β-catenin protein expression (< 0.01).Xiaoer Guangpu Zhixie Oral Liquid may treat diarrhea by inhibiting inflammatory response and apoptosis.

Xiaoer Guangpu Zhixie Oral Liquid; diarrhea; IEC-6 cells; anti-inflammation; apoptosis; molecular docking; cerevisterol; rutin

R285.5

A

0253 - 2670(2022)08 - 2390 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.016

2021-12-24

陳 琦（1993—），女，博士，研究方向?yàn)橹兴幩幚?。Tel: 13770610886 E-mail: qichen@njucm.edu.cn

卞慧敏，博士生導(dǎo)師，研究員，主要從事心血管藥理研究。E-mail: 320561@njucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]