李 澤，尹 芳，楊 苗，于文靜，羅榮司慶，周金勇，李 平，宋禎彥，成紹武

基于CREB/Bcl-2信號通路探究當(dāng)歸芍藥散改善Aβ誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元凋亡的作用機(jī)制

李 澤，尹 芳，楊 苗，于文靜，羅榮司慶，周金勇，李 平，宋禎彥*，成紹武*

湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208

探究當(dāng)歸芍藥散對β淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。以30 μmol/L Aβ25-35誘導(dǎo)基底前腦膽堿能神經(jīng)元損傷模型，給予2.5%、5.0%和10.0%當(dāng)歸芍藥散含藥血清進(jìn)行干預(yù)，采用MTT法檢測細(xì)胞存活率；TUNEL法和碘化丙啶（PI）/Hoechst熒光雙染檢測神經(jīng)元凋亡情況；采用膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（choline acetyltransferase，ChAT）/磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（phosphorylated cAMP-response element binding protein，p-CREB）和ChAT/剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）熒光雙染檢測當(dāng)歸芍藥散對膽堿能神經(jīng)元的抗凋亡情況；采用Western blotting法檢測CREB/B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。5.0%和10.0%當(dāng)歸芍藥散含藥血清可顯著增加Aβ誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元存活率（＜0.01），改善Aβ誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元凋亡（＜0.01），降低Caspase-3活化水平（＜0.01）；10%當(dāng)歸芍藥散含藥血清能逆轉(zhuǎn)Aβ誘導(dǎo)p-CREB水平的降低（＜0.01），增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)（＜0.05）。當(dāng)歸芍藥散可能通過CREB/Bcl-2信號通路改善Aβ誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元凋亡。

當(dāng)歸芍藥散；β淀粉樣蛋白；膽堿能神經(jīng)元；細(xì)胞凋亡；環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白；B淋巴細(xì)胞瘤2

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，其特征為記憶力的進(jìn)行性喪失和高級認(rèn)知功能的惡化。目前，導(dǎo)致AD進(jìn)行性記憶喪失的的具體機(jī)制仍不清楚[1]。在許多關(guān)于AD發(fā)病機(jī)制的假說中，膽堿能假說是唯一將記憶喪失與特定神經(jīng)元子集聯(lián)系在一起的假說?；浊澳X膽堿能神經(jīng)元是記憶功能的基礎(chǔ)，無論是β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）富集的老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)的特征性改變，還是突觸的炎癥，最終都會匯集到AD廣泛的基底前腦膽堿能神經(jīng)元丟失[2]。環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）是參與大腦發(fā)育、神經(jīng)存活和神經(jīng)發(fā)生的主要轉(zhuǎn)錄因子，大量的研究發(fā)現(xiàn)CREB介導(dǎo)的信號通路在記憶的形成過程和AD的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，激活CREB途徑能抑制膽堿能神經(jīng)元凋亡，改善AD大鼠的記憶障礙[4]。針對膽堿能系統(tǒng)的AD藥物干預(yù)也主要作用于CREB相關(guān)通路[5]，美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)的AD膽堿酯酶抑制劑類藥物如多奈哌齊、利斯的明等能增加乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）水平，但它們的療效相對較低，且存在嘔吐、腹瀉、頭暈等不良反應(yīng)[6]。當(dāng)歸芍藥散出自張仲景《金匱要略》，經(jīng)臨床驗(yàn)證其是治療AD的有效方劑[7-8]，實(shí)驗(yàn)研究證明該方可通過抑制神經(jīng)炎癥、抑制神經(jīng)元凋亡、抗氧化等途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，并能改善AD動(dòng)物模型的認(rèn)知功能障礙[9-12]。已有研究表明，該方的君藥當(dāng)歸提取物當(dāng)歸多糖可通過激活腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF/酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase B，TrkB）/CREB途徑提高Ach和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（choline acetyltransferase，ChAT）水平改善AD大鼠的記憶障礙[13]。本研究以Aβ25-35誘導(dǎo)基底前腦神經(jīng)元構(gòu)建AD細(xì)胞模型，探究當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ25-35誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級妊娠SD大鼠5只，體質(zhì)量380～420 g，7周齡；SPF級雄性SD大鼠10只，體質(zhì)量220～260 g，5周齡，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2013-0004。動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室內(nèi)溫度20～24 ℃，相對濕度35%～45%，室內(nèi)光線12 h明暗交替。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號LL-2020071501）。

1.2 藥品與試劑

Aβ25-35（批號A4559）、Forskolin（批號F6886）、ChAT鼠抗（批號MAB5270）、山羊抗兔二抗（批號AP132P）、山羊抗鼠二抗（批號AP124）購自美國Sigma-Aldrich公司；MTT（批號M8180）、胰蛋白酶-EDTA消化液（批號T1320）購自北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號D806645）購自上海麥克林生化科技有限公司；B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）兔抗（批號ab194583）購自英國Abcam公司；剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）兔抗（批號9661）、CREB兔抗（批號9197）、p-CREB兔抗（批號9198）、β-actin鼠抗（批號3700）購自美國CST公司；驢抗鼠熒光二抗Alexa Fluor 488（批號A-10680）、驢抗兔熒光二抗Cy3（批號A10520）、Hoechst 33258（批號H1398）、紅色熒光碘化丙啶（PI）染料（批號P1304MP）購自美國Invitrogen公司；Triton X-100（批號9002-93-1）、5×上樣緩沖液（批號P0015L）購自碧云天公司；RIPA裂解液（批號01408/504074）購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；ProLong?玻璃抗淬滅封片劑（含NucBlue?染色劑，批號P36983）、BCA蛋白定量分析試劑盒（批號NCI3227CH）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 儀器

ChemiDoc XRS＋化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；Medifuge?小型臺式離心機(jī)、Series 8000 WJ CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Cytation3多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；A1+共聚焦激光顯微鏡（日本Nikon公司）；AxioVert.A1倒置熒光顯微鏡（德國Zeiss公司）。

2 方法

2.1 當(dāng)歸芍藥散含藥血清制備

按照本課題組前期研究方法，當(dāng)歸芍藥散采用水提法進(jìn)行提取，通過旋轉(zhuǎn)蒸餾濃縮和凍干制備凍干粉并進(jìn)行質(zhì)量控制，以阿魏酸、芍藥苷、藁本內(nèi)酯、白術(shù)內(nèi)酯I和乙酰澤瀉醇B為對照品鑒定當(dāng)歸芍藥散凍干粉主要成分含量，當(dāng)歸芍藥散提取液中阿魏酸、芍藥苷、藁本內(nèi)酯、白術(shù)內(nèi)酯I和乙酰澤瀉醇B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為148.2、5320、400.7、7.2和26.7 mg/kg[14]。100 g生藥制備凍干粉為12.6 g，根據(jù)動(dòng)物體質(zhì)量配制質(zhì)量濃度為生藥2 g/mL（凍干粉0.252 g/mL）的口服液。取雄性SD大鼠10只隨機(jī)分為當(dāng)歸芍藥散含藥血清組和對照組，每組5只，當(dāng)歸芍藥散含藥血清組大鼠ig當(dāng)歸芍藥散口服液（生藥24 g/kg），對照組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)7 d，末次給藥2 h后ip 10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉，暴露腹主動(dòng)脈，用負(fù)壓采血管采集全血5 mL至無抗凝劑的普通采血管中，靜置過夜，3000 r/min離心10 min，收集上清，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，?80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 膽堿能神經(jīng)元的提取

原代膽堿能神經(jīng)元取自胚胎期16～18 d的SD大鼠，妊娠大鼠ip 50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，斷頭處死。取出胚胎，解剖分離基底前腦，放入解剖緩沖液中（HBSS、10 mmol/L HEPES、1%青霉素/鏈霉素）。組織用0.25%胰蛋白酶消化15 min后，加入脫氧核糖核酸酶/胰蛋白酶抑制劑溶液研磨分解，臺盼藍(lán)篩選活細(xì)胞。神經(jīng)元以1.5×105/cm2的密度于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)液含有2% B-27和1%青霉素/鏈霉素，培養(yǎng)環(huán)境37 ℃、5% CO2。以5 μmol/L阿糖胞苷作用48 h抑制非神經(jīng)元細(xì)胞生長。

2.3 Aβ誘導(dǎo)膽堿能神經(jīng)元模型的構(gòu)建

Aβ25-35用PBS溶液配制成100 mg/mL的母液，于37 ℃老化48 h。提取基底前腦神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，在含有不同濃度Aβ25-35（15、30、60 μmol/L）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h，構(gòu)建Aβ誘導(dǎo)模型。

2.4 MTT檢測細(xì)胞存活率

膽堿能神經(jīng)元以5×103/孔接種于96孔板中，設(shè)置對照組、模型組和當(dāng)歸芍藥散（2.5%、5.0%、10.0%）組，模型組給予30 μmol/L Aβ25-35處理16 h，各給藥組在構(gòu)建Aβ誘導(dǎo)模型后，分別加入2.5%、5.0%、10.0%當(dāng)歸芍藥散含藥血清處理24 h，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基。吸棄孔中培養(yǎng)液，每孔加入含5 mg/mL MTT的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，搖勻后采用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(實(shí)驗(yàn)－調(diào)零)/(對照－調(diào)零)

2.5 神經(jīng)元凋亡的測定

膽堿能神經(jīng)元以5×104/孔接種于12孔板中，模型組用30 μmol/L Aβ25-35處理16 h，當(dāng)歸芍藥散（5%、10%）組在構(gòu)建Aβ誘導(dǎo)模型后，分別加入5%、10%當(dāng)歸芍藥散含藥血清處理24 h。吸棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的含5%冰醋酸的甲醇于4 ℃固定45 min，PBS洗滌3次，用3%牛血清白蛋白于室溫封閉1 h；用Hoechst 33258和PI染色以及TUNEL檢測細(xì)胞凋亡。采用A1＋共聚焦激光顯微鏡和AxioVert.A1倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡特征并拍照。

2.6 當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元Caspase-3活化的影響

2.6.1 免疫熒光檢測膽堿能神經(jīng)元ChAT和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá) 在12孔板中放置圓形蓋玻片，接種5×104個(gè)細(xì)胞使細(xì)胞爬片，模型組用30 μmol/L Aβ25-35處理16 h，5%、10%當(dāng)歸芍藥散組在構(gòu)建Aβ誘導(dǎo)模型后，分別加入5%、10%當(dāng)歸芍藥散含藥血清處理24 h。按“2.5”項(xiàng)下方法固定細(xì)胞并封閉，PBS清洗3次，分別加入ChAT鼠抗（1∶100）和cleaved Caspase-3兔抗（1∶200），4 ℃孵育過夜，PBS清洗3次，分別加入驢抗鼠熒光二抗Alexa Fluor 488（1∶600）、驢抗兔Cy3（1∶600），室溫孵育1 h；PBS洗滌3次，從孔板中撈出圓形蓋玻片，反向扣于載玻片上，用抗淬滅封片劑封片固定，采用A1＋共聚焦激光顯微鏡觀察和拍照。

2.6.2 圖像獲取與計(jì)數(shù) ChAT/Caspase-3雙染色免疫熒光實(shí)驗(yàn)采用基底前腦細(xì)胞重復(fù)培養(yǎng)3次。對于每次重復(fù)，每個(gè)條件至少分析2個(gè)玻片。細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，每張玻片隨機(jī)獲得10個(gè)目標(biāo)區(qū)域（20×物鏡，每個(gè)視野含有約40～50個(gè)細(xì)胞）。不同階段A1＋共聚焦激光顯微鏡觀察，每個(gè)通道采集參數(shù)設(shè)置（增益、曝光時(shí)間、激光強(qiáng)度）保持固定。計(jì)數(shù)具有完整的細(xì)胞核、共定位胞質(zhì)cleaved Caspase-3和ChAT的細(xì)胞。最終結(jié)果顯示cleaved Caspase-3陽性細(xì)胞與ChAT陽性神經(jīng)元或ChAT陰性神經(jīng)元的百分比。

2.6.3 Western blotting檢測膽堿能神經(jīng)元cleaved Caspase-3蛋白表達(dá) 按“2.6.1”項(xiàng)下方法分組并處理細(xì)胞，收集細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液勻漿，4 ℃孵育30 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清。用BCA蛋白定量分析試劑盒測定上清液的總蛋白含量。加入5×上樣緩沖液，100 ℃金屬浴20 min，使蛋白變性，于?80 ℃保存。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，于室溫封閉1 h；分別加入兔抗cleaved Caspase-3（1∶1000）和鼠抗β-actin（1∶5000），4 ℃孵育過夜；吸棄一抗，TBST洗滌3次，每次10 min，孵育對應(yīng)二抗，37 ℃孵育1 h；吸棄二抗，TBST洗滌3次，每次10 min，加入顯影液，采用凝膠成像儀成像分析。

2.7 當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元CREB/Bcl-2通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.7.1 免疫熒光檢測膽堿能神經(jīng)元ChAT和p-CREB蛋白表達(dá) 在12孔板中放置圓形蓋玻片，接種5×104個(gè)細(xì)胞使細(xì)胞爬片，模型組用30 μmol/L Aβ25-35處理16 h，F(xiàn)orskolin組和10%當(dāng)歸芍藥散組在構(gòu)建Aβ誘導(dǎo)模型后，分別加入10 μmol/L Forskolin、10%當(dāng)歸芍藥散含藥血清處理24 h。吸棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的含5%冰醋酸的甲醇于4 ℃固定45 min，PBS洗滌3次，用3%牛血清白蛋白于室溫封閉1 h；PBS清洗3次，分別加入ChAT鼠抗（1∶100）和p-CREB兔抗（1∶200），4 ℃孵育過夜，PBS清洗3次，分別加入驢抗鼠熒光二抗Alexa Fluor 488（1∶600）、驢抗兔Cy3（1∶600），室溫孵育1 h；PBS洗滌3次，從孔板中撈出圓形蓋玻片，反向扣于載玻片上，用抗淬滅封片劑封片固定，采用A1＋共聚焦激光顯微鏡觀察和拍照。

2.7.2 Western blotting檢測膽堿能神經(jīng)元p-CREB、CREB和Bcl-2蛋白表達(dá) 按“2.7.1”項(xiàng)下方法分組并處理細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，于室溫封閉1 h；分別加入鼠抗p-CREB（1∶1000）、兔抗CREB（1∶1000）、兔抗Bcl-2（1∶1000）和鼠抗β-actin（1∶5000），4 ℃孵育過夜；吸棄一抗，TBST洗滌3次，每次10 min，孵育對應(yīng)二抗，37 ℃孵育1 h；吸棄二抗，TBST洗滌3次，每次10 min，加入顯影液，采用凝膠成像儀成像分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行采用單因素方差分析，計(jì)量資料以表示，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞存活率的影響

采用MTT檢測不同濃度Aβ25-35（15、30、60 μmol/L）作用于膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞的存活率，細(xì)胞活率分別為82%、51%、40%，因此選取30 μmol/L Aβ25-35作為Aβ誘導(dǎo)膽堿能神經(jīng)元損傷模型濃度。當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ?lián)p傷膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞存活率的影響如圖1所示，2.5%、5.0%、10.0%當(dāng)歸芍藥散作用于Aβ?lián)p傷膽堿能神經(jīng)元的細(xì)胞存活率分別為60%、87%和92%，與模型組相比，5.0%、10.0%當(dāng)歸芍藥散組膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞存活率顯著升高（＜0.01），提示當(dāng)歸芍藥散能夠提升Aβ?lián)p傷膽堿能神經(jīng)元的細(xì)胞存活率，且呈劑量相關(guān)性。

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下圖同

3.2 當(dāng)歸芍藥散含藥血清改善Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡

TUNEL染色和PI/Hoechest細(xì)胞凋亡染色結(jié)果見圖2，與模型組相比，5%、10%當(dāng)歸芍藥散能夠明顯減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)（＜0.01），PI陽性細(xì)胞率也顯著降低（＜0.01），且呈劑量相關(guān)性，表明當(dāng)歸芍藥散含藥血清能抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。

3.3 當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元Caspase-3活化的影響

為了進(jìn)一步明確當(dāng)歸芍藥散是否對膽堿能神經(jīng)元凋亡有抑制作用，采用膽堿能神經(jīng)元標(biāo)志物ChAT與凋亡標(biāo)志物cleaved Caspase-3進(jìn)行免疫熒光雙染。如圖3所示，Aβ毒性作用下基底前腦神經(jīng)元ChAT表達(dá)明顯減少，神經(jīng)元相連的胞體崩解破碎，cleaved Caspase-3表達(dá)明顯增加；給予當(dāng)歸芍藥散含藥血清干預(yù)后，神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于完整，ChAT表達(dá)明顯增加，cleaved Caspase-3表達(dá)明顯減少。進(jìn)一步檢測了基底前腦神經(jīng)元cleaved Caspase-3表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示，與對照組相比，模型組促凋亡蛋白cleaved Caspase-3表達(dá)水平明顯升高（＜0.01），5%、10%當(dāng)歸芍藥散含藥血清能夠顯著降低cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平（＜0.01），且呈劑量相關(guān)性。

圖2 當(dāng)歸芍藥散含藥血清改善Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡

圖3 當(dāng)歸芍藥散含藥血清減少Aβ誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)

3.4 當(dāng)歸芍藥散含藥血清通過CREB/Bcl-2通路抑制Aβ誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元凋亡

ChAT/p-CREB熒光雙染結(jié)果如圖4所示，Aβ毒性作用下基底前腦神經(jīng)元胞體內(nèi)p-CREB表達(dá)明顯減少，給予腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑Forskolin后p-CREB表達(dá)顯著增加，10%當(dāng)歸芍藥散含藥血清組p-CREB表達(dá)顯著增加，與Forskolin效果類似。進(jìn)一步檢測CREB/Bcl-2通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，模型組p-CREB和Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低（＜0.01）；與模型組相比，F(xiàn)orskolin和10%當(dāng)歸芍藥散含藥血清組p-CREB和Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01）。

圖4 當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元CREB/Bcl-2通路的影響

4 討論

中藥含藥血清是方劑藥理學(xué)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)常用的媒介，當(dāng)歸芍藥散全方由當(dāng)歸、芍藥、川芎、茯苓、白術(shù)和澤瀉6味中藥組成，其中主要藥效成分有單萜苷類成分芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷，機(jī)酸類成分阿魏酸、三萜類成分24-乙酰澤瀉醇A和24-乙酰澤瀉醇B，以及白術(shù)內(nèi)酯I和茯苓酸。本課題組前期已有研究用HPLC-MS/MS技術(shù)測定當(dāng)歸芍藥散提取物和含藥血清中阿魏酸、芍藥苷和茯苓酸的含量，用于該方提取物及含藥血清的質(zhì)量控制[15]，并驗(yàn)證了當(dāng)歸芍藥散含藥血清具有減少氧化損傷、抗神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)保護(hù)作用[10-11]。因此，本研究以此為基礎(chǔ)來驗(yàn)證當(dāng)歸芍藥散含藥血清改善Aβ誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元凋亡的作用機(jī)制。

越來越多的證據(jù)表明Aβ的過度積累是導(dǎo)致AD的最重要的病理事件，Aβ具有直接的神經(jīng)元毒性，同時(shí)Aβ的過度沉積會引起神經(jīng)元炎癥反應(yīng)間接損害神經(jīng)元，最終表現(xiàn)為神經(jīng)元凋亡[16]。膽堿能功能障礙是AD患者記憶加工障礙的主要原因之一。Ach是一種神經(jīng)遞質(zhì)，在組織內(nèi)迅速被膽堿酯酶破壞。在神經(jīng)細(xì)胞中，Ach由膽堿和乙酰輔酶A在ChAT的催化作用下合成，ChAT是參與Ach合成的關(guān)鍵膽堿能標(biāo)記物[17]。研究認(rèn)為，人體內(nèi)Ach含量增多與阿爾茲海默病的癥狀改善顯著相關(guān)，Ach的維持對正常功能至關(guān)重要，AD患者中ChAT的缺陷和酶活性降低會導(dǎo)致大腦中Ach水平顯著降低[18]。過表達(dá)ChAT的人類神經(jīng)干細(xì)胞可以通過釋放Ach恢復(fù)膽堿能神經(jīng)元功能，同時(shí)能恢復(fù)小膠質(zhì)細(xì)胞功能，減少Aβ沉積，從而改善AD動(dòng)物的認(rèn)知功能[19]。本研究結(jié)果表明，Aβ毒性作用下可顯著降低基底前腦神經(jīng)元ChAT蛋白表達(dá)，同時(shí)誘發(fā)神經(jīng)元凋亡，提示所觀察到的神經(jīng)元凋亡是膽堿能功能障礙所致。而當(dāng)歸芍藥散含藥血清可明顯減輕Aβ介導(dǎo)的膽堿能功能障礙，發(fā)揮與腺苷酸環(huán)化酶激活劑Forskolin類似的作用。

CREB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄可由膜受體刺激并激活細(xì)胞內(nèi)通路將信號傳遞到細(xì)胞核來啟動(dòng)，被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和記憶所需的分子開關(guān)，CREB磷酸化被認(rèn)為是導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄激活的原因，可產(chǎn)生腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）等細(xì)胞因子，在突觸可塑性和認(rèn)知功能中起關(guān)鍵作用[20]。CREB磷酸化過程受損是神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)已知病理因素，通過促進(jìn)凋亡的過程觸發(fā)海馬和皮層神經(jīng)元的丟失[21]。CREB的抑制會影響各種記憶測試中的行為表現(xiàn)。相反，CREB的過度表達(dá)抑制了神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并通過激活CREB/神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）信號通路恢復(fù)膽堿能和抗凋亡活性，從而改善東莨菪堿毒性所致的小鼠認(rèn)知功能障礙[22]。因此在與認(rèn)知相關(guān)的大腦區(qū)域中通過藥物干預(yù)誘導(dǎo)CREB磷酸化，可能成為開發(fā)治療AD藥物的新途徑。Bcl-2的上游啟動(dòng)子區(qū)域有1個(gè)CREB結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)已被證明是由CREB的激活引起B(yǎng)細(xì)胞活化來挽救細(xì)胞凋亡，說明CREB/Bcl-2通路具有抗凋亡作用[23]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)歸芍藥散含藥血清顯著增加了CREB在基底前腦神經(jīng)元的磷酸化水平。此外，與對照組相比，當(dāng)歸芍藥散含藥血清治療后基底前腦神經(jīng)元抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著增加，凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase-3的表達(dá)顯著降低。TUNEL染色實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)歸芍藥散含藥血清治療后，基底前腦神經(jīng)元凋亡明顯減少。這些結(jié)果表明當(dāng)歸芍藥散含藥血清可能通過激活CREB磷酸化和CREB/Bcl-2通路抑制神經(jīng)元凋亡，從而發(fā)揮膽堿能神經(jīng)元保護(hù)作用。

綜上，本研究證明了當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Aβ所致基底前腦神經(jīng)元膽堿能系統(tǒng)損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是激活CREB/Bcl-2信號通路和抑制凋亡相關(guān)通路，從而對膽堿能系統(tǒng)發(fā)揮保護(hù)作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Danggui Shaoyao San on ameliorating Aβ-induced apoptosis of cholinergic neurons based on CREB/Bcl-2 signaling pathway

LI Ze, YIN Fang, YANG Miao, YU Wen-jing, LUO Rong-si-qing, ZHOU Jin-yong, LI Ping, SONG Zhen-yan, CHENG Shao-wu

Hunan Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine on Prevention and Treatment of Cardio-Cerebral Diseases, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

To study the protective effect and mechanism of Danggui Shaoyao San (當(dāng)歸芍藥散, DSS) on amyloid β-protein (Aβ)-induced cholinergic neuron injury.Basal forebrain neuron injury model was induced by 30 μmol/L Aβ25-35, 2.5%, 5.0% and 10.0% DSS containing serum were given for intervention, MTT assay was used to detect cell survival rate; TUNEL and PI/Hoechst fluorescence staining were used to detect neuronal apoptosis; Choline acetyltransferase (ChAT)/phosphorylated cAMP-response element binding protein (p-CREB) and ChAT/cleaved cystein-asparate protease-3 (Caspase-3) fluorescence double staining were used to detect the anti-apoptotic effect of DSS on cholinergic neurons; Western blotting was used to detect the expressions of CREB/B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) signaling pathway related proteins.DSS serum (5.0% and 10.0%) significantly increased the cell survival rate of Aβ-injured cholinergic neurons (< 0.01), improved Aβ-induced apoptosis (< 0.01) and decreased activation level of Caspase-3 (< 0.01). DSS serum (10%) reversed Aβ-induced decrease in p-CREB level (< 0.01) and increased expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 (< 0.05).DSS may ameliorate Aβ-induced apoptosis of cholinergic neurons through CREB/Bcl-2 signaling pathway.

Danggui Shaoyao San; amyloid β-protein; cholinergic neuron; apoptosis; cAMP-response element binding protein; B-cell lymphoma 2

R285.5

A

0253 - 2670(2022)08 - 2376 - 07

.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.014

2021-12-28

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81774129）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82004184）；湖南省教育廳科研基金重點(diǎn)項(xiàng)目（21A0241）；2019年湖湘高層次人才聚集工程-創(chuàng)新人才（2019RS1064）；2021年度湖南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（S202110541049）

李 澤，碩士，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合神經(jīng)退行性疾病防治研究。E-mail: 769428761@qq.com

宋禎彥，碩士，高級實(shí)驗(yàn)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合神經(jīng)退行性疾病防治研究。E-mail: songzhenyan2013@hnucm.edu.cn

成紹武，博士，教授，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合防治神經(jīng)退行性疾病。E-mail: scheng@hnucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]