張 梅，況 剛，張有金，雷燕莉，譚瑤琳，余志晴，段思洋，劉 濤, 6*

基于設計空間法優(yōu)化北劉寄奴-骨碎補的提取工藝研究

張 梅1，況 剛2，張有金3，雷燕莉4，譚瑤琳5，余志晴4，段思洋4，劉 濤1, 6*

1. 成都大學食品與生物工程學院，四川 成都 610106 2. 重慶第二師范學院生物與化學工程學院，重慶 400047 3. 成都大學臨床醫(yī)學院，四川 成都 610081 4. 成都大學藥學院，四川 成都 610106 5. 廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西 南寧 530200 6. 四川省抗病毒中藥產業(yè)化工程技術研究中心，四川 成都 610106

采用網絡藥理學和設計空間法優(yōu)化北劉寄奴-骨碎補的提取工藝，確定其提取工藝參數范圍，提高原藥材利用率，減少能源損耗，以達到減少碳排放量和保護環(huán)境的目的。利用網絡藥理學方法篩選出活性成分，同時結合《中國藥典》2020年版一部相關北劉寄奴、骨碎補項下確定柚皮苷、木犀草素為指標性成分，采用Minitab 17軟件進行Plackett-Burman實驗設計，初步確定提取次數、提取時間以及加溶媒倍數為關鍵工藝參數（critical process parameters，CPP），通過軟件Design-Expert 10進行Box-Behnken 3因素3水平實驗設計，建立關鍵質量屬性（critical quality attribute，CQA）和CPP間的數學模型，最后通過Monte Carlo法計算獲得基于概率的設計空間，并對點內、點外進行驗證。確定最佳提取工藝為乙醇體積分數45%，提取次數3次，每次提取時間2～3 h，加溶媒倍數為11～15倍。運用設計空間法優(yōu)化北劉寄奴-骨碎補提取工藝所得到的理論值與預測值結果接近，表明該法穩(wěn)定可靠，可避免常規(guī)設計方法潛在的過度提取弊端，在大生產中可以節(jié)約資源和減少碳排放。

網絡藥理學；設計空間法；北劉寄奴；骨碎補；柚皮苷；木犀草素；Plackett-Burman實驗設計；關鍵工藝參數；關鍵質量參數；Monte Carlo法

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）主要是脊柱產生病變，累及骶髂關節(jié)，引起脊柱纖維化和強直的自身免疫疾病[1-2]。國內強直性脊柱炎患者多發(fā)群體集中于青壯年，發(fā)病率為0.3%左右[3-4]，且男性較女性易發(fā)，發(fā)病率是女性的3倍左右[5]。大多數醫(yī)家認為AS的病因病機為腎督虧虛[6]，臨床研究也表明AS早期為骨代謝異常導致骨質炎癥，閻小萍等[7]認為可通過增強骨密度、提高骨代謝，以降低脊柱至畸概率。因此，早期監(jiān)控骨代謝變化、預防骨折及骨質疏松發(fā)生顯得尤為重要?，F已有相關實驗表明，可以通過抑制基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）、MMP-9、組織因子（tissue factor，TF）、Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶1（Rho associated coiled coil forming protein kinase 1，ROCK1）等AS相關基因介導的血管平滑肌細胞增殖，從而抑制AS病變蔓延至其他部位[8-11]。

骨碎補為水龍骨科槲蕨屬植物槲蕨(Kunze) J. Sm.的干燥根莖，性溫，味苦，歸肝腎二經，有療傷止痛、補腎強骨、益督活血的功效[12]，現代藥理研究表明，骨碎補有增加成骨細胞增殖分化、抑制破骨細胞性骨吸收、改善骨代謝以及促使骨髓間充質干細胞成骨分化作用，臨床常用于抗骨質疏松癥和促進骨折愈合[13]，目前已有骨碎補總黃酮膠囊上市銷售。北劉寄奴為玄參科陰行草屬植物陰行草Benth.的干燥全草，性寒，味苦，歸脾、胃、肝、膽經，中醫(yī)藥理論認為腰為腎之府，腰病變至腎督虧虛，AS早期肝血不足者筋得不到濡養(yǎng)，有腰背疼痛之狀，直至僵硬，嚴重者使脊柱和外周關節(jié)產生病變[14-15]。本課題組前期研究表明北劉寄奴、骨碎補進行配伍用于治療AS有較好的療效。

設計空間法建立的設計空間使中藥材工藝參數在一定范圍內波動，徐冰等[16]認為藥品生產工藝參數在設計空間內則可無需再進行申報，可提高藥品監(jiān)管的靈活性，節(jié)約大量人力、財力以及物力。中藥提取工藝是中藥制造業(yè)中至關重要的一步，傳統(tǒng)固定工藝參數模式進行提取往往要消耗大量溶劑和熱能。一些藥物在前期上市研究時，其工藝參數確定的指標可能與藥物活性無關，因此，目前國家鼓勵對復方制劑的制備工藝進行持續(xù)評價與改進。而質量源于設計（quality by design，QbD）理念則主要是對中藥材的關鍵質量屬性（critical quality attribute，CQA）和工藝參數（critical process parameters，CPP）進行研究，并以藥物活性成分為指標，確定工藝參數范圍，保證產品質量在可靠工藝范圍內運行，減少生產中批次不合格問題，從而有力的保證產品質量，可達到降低能源消耗，達到“低碳”目的。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SQP電子天平，奧多利斯科學儀器有限公司；FA-2004分析電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；BT-6000分析電子天平，上海友聲衡器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋，常州朗越儀器制造有限公司；800Y型高速多功能粉碎，永機康市鉑歐五金制品有限公司；PS-40超聲波清洗器，深圳得康清洗設備有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，北京科偉永興儀器有限公司；OH6-903385-III電熱鼓風干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；ZDHW調溫電熱套，北京中興偉業(yè)世紀儀器有限公司；Eclassical 3200高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司。

1.2 材料

北劉寄奴（批號210425）、骨碎補（批號210425）均購自四川省成都市荷花池中藥材市場，經成都大學食品與生物工程學院劉濤教授鑒定，分別為玄參科陰行草屬植物陰行草Benth.的干燥全草、水龍骨科槲蕨屬植物槲蕨(Kunze) J. Sm.的干燥根莖；對照品柚皮苷（批號wkq21020606）、木犀草素（批號wkq21040905），質量分數均≥98%，均購自四川省維克奇生物科技有限公司；用于液相分析的甲醇、乙腈為色譜級，質量分數均≥99.9%，磷酸（批號2019010201）、冰乙酸（批號2020123001）、95%乙醇（批號2020040901）、甲醇（批號2020040902）為分析級，均購自成都市科隆化學品有限公司；怡寶純凈水，華潤怡寶飲料（中國）有限公司。

2 方法與結果

2.1 藥物活性成分篩選

為確定提取工藝指標成分與臨床療效相關，采用中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）分別以北劉寄奴、骨碎補為關鍵詞檢索，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18為篩選條件，得到兩者活性成分，并對活性成分的相關靶標進行搜集[17-20]。

以“ankylosing spondylitis”為關鍵詞，利用Uniprot數據庫、GengCards數據庫以及結合Venny 2.1.0在線工作站得到MMP2、MMP9、白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、IL-4等48個藥物-疾病交集基因。將STRING軟件分析結果導入Cytoscape 3.7.2軟件數據進行可視化分析，構建成分-靶點基因互作網絡圖[21-25]（圖1），根據網絡拓撲參數分析篩選出的重要節(jié)點多來源于木犀草素（MOL000006）和柚皮苷（MOL004328），再結合《中國藥典》2020年版一部相關北劉寄奴、骨碎補項下最終確定柚皮苷、木犀草素為后續(xù)研究中的指標性成分，文獻研究也表明，這2種成分具有治療強直性脊柱炎的作用[26-27]。

2.2 活性成分柚皮苷、木犀草素的測定

2.2.1 對照品溶液制備 取柚皮苷、木犀草素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含柚皮苷70.0 μg/mL、木犀草素70.6 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取“1.2”項下2味中藥飲片（配伍比例1∶1）適量（各25 g），加11.5倍體積分數為45%乙醇，提取1次，提取1 h，濾過，待冷卻至室溫，抽濾，量取總體積，取適量濾液經0.45 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

圖1 成分-靶點基因互作網絡圖

2.2.3 色譜條件[28-29]采用Supersil ODS色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；體積流量為1 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量為10 μL；檢測波長270 nm；以乙腈-0.1%冰乙酸水溶液為流動相，梯度洗脫：0～15 min，15%～33%乙腈；15～25 min，33%～51%乙腈；25～30 min，51%～15%乙腈；30～35 min，15%～15%乙腈。

2.2.4 專屬性試驗 精密移取“2.2.1”項下混合對照品溶液和“2.2.2”項下供試品溶液各10 μL，按“2.2.3”項下色譜條件進行含量測定，結果表明供試品色譜峰與對照品色譜峰的保留時間一致對應。色譜圖見圖2。

2.2.5 線性關系考察 取“2.2.1”項下混合對照品溶液，用甲醇稀釋成不同質量濃度的系列混合對照品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進行測定，以混合對照品質量濃度為橫坐標（），峰面積為縱坐標（），進行線性回歸，得到柚皮苷回歸方程＝10 307＋9 162.6，＝0.999 9，線性范圍4.375～70.000 μg/mL；木犀草素回歸方程＝34 051＋12 810，＝0.999 7，線性范圍4.4～70.4 μg/mL；結果表明，柚皮苷、木犀草素在各自線性范圍內線性關系良好。

圖2 混合對照品(A) 和北劉寄奴-骨碎補供試品(B) 的HPLC圖

2.2.6 精密度試驗 精密移取“2.2.1”項下對照品溶液10 μL，按“2.2.3”項下色譜條件，連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積，計算柚皮苷、木犀草素的峰面積的RSD分別為2.93%、2.13%，結果表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 精密稱取“1.2”項下北劉寄奴、骨碎補適量，依“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、16、20、24 h后分別進樣10 μL，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果表明，柚皮苷、木犀草素峰面積的RSD分別為2.15%、4.86%，即供試品溶液在室溫下放置24 h基本穩(wěn)定。

2.2.8 重復性試驗 精密稱取“1.2”項下北劉寄奴、骨碎補6份，依“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄柚皮苷、木犀草素峰面積并計算其含量。結果表明柚皮苷、木犀草素質量分數的RSD分別為4.76%、4.38%，表明該色譜條件下測定重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 精密移取已測定柚皮苷、木犀草素含量的北劉寄奴骨碎補各12.5 g，分別添加藥材中等量的柚皮苷和木犀草素的對照品溶液，依“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。計算得柚皮苷、木犀草素的平均回收率分別為94.23%、96.31%，RSD分別為2.36%、3.41%。

2.2.10 樣品測定 將“2.2.2”項下制備的供試品溶液按“2.2.3”項下色譜條件進行測定。

2.3 干膏率測定

精密量取北劉寄奴-骨碎補提取液50 mL，置于已恒定質量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘箱中干燥3 h，在干燥器中冷卻30 min，迅速稱定質量，計算干膏率。

干膏率＝/50

表示50 mL提取液的干膏質量，表示總提取液體積，表示生藥材質量

2.4 CPP和CQA的確定

對北劉寄奴-骨碎補提取過程中提取次數（1）、提取時間（2）、加溶媒倍數（3）以及乙醇體積分數（4）進行篩選和風險評估，將柚皮苷提取量（1）、木犀草素提取量（2）以及干膏率（3）作為北劉寄奴-骨碎補中間體制備工藝的CQA。

2.4.1 單因素實驗 取“1.2”項下2味中藥飲片適量，分別加入10倍量水及45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%乙醇，提取2次，每次提取1 h[30-33]，濾過，合并2次濾液，待冷卻至室溫，抽濾，量取總體積，取適量濾液經0.45 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。綜合評分結果見表1，可知用體積分數為45%乙醇進行提取各項指標較好。

綜合評分＝干膏率/最大干膏率×20＋木犀草素量/最大木犀草素量×40＋柚皮苷量/最大柚皮苷量×40

表1 溶媒篩選結果表

Table 1 Solvent screening results table

試驗號X1/次X2/hX3/倍X4/%Y1/mgY2/mgY3/%綜合評分 11210075.600.198.7538.00 2121045170.1922.268.7895.60 3121050112.5014.767.6867.54 4121055122.8021.267.9681.00 51210606.0420.638.1152.89 612106595.4923.977.7678.46 7121070154.6525.017.7093.89 8121075138.5421.157.2682.93

2.4.2 CPP確定 利用Minitab 17軟件對提取次數（1）、提取時間（2）、加溶媒倍數（3）以及乙醇體積分數（4）進行Plackett-Burman實驗設計，Plackett-Burman實驗設計與結果見表2。

分別以1～3對1～4進行線性回歸，得回歸方程1＝?14.5＋25.001＋19.182＋2.143＋0.0894；2＝?4.39＋3.431＋0.972＋0.8453＋0.0044；3＝0.014 5＋0.020 431＋0.011 472＋1.633×10?33－2.15×10?44。方差分析見表3，由表3可知13均對12或3顯著，標準化效應的pareto圖見圖3，由圖3可知效應值影響較大的工藝參數分別為1、2、3。結合方差分析和pareto圖最終確定提取次數1、提取時間2、加溶媒倍數3作為本研究中的關鍵工藝參數。

2.4.3 Box-Behnken實驗設計 為考察提取次數（1）、提取時間（2）、加溶媒倍數（3）對北劉寄奴-骨碎補提取工藝的影響規(guī)律，利用軟件Design-Expert10中Box-Behnken設計3因素3水平實驗，得到17個試驗點，其中中心點重復5次試驗，Box-Behnken實驗設計與結果見表4。

表2 Plackett-Burman實驗設計與結果

Table 2 Plackett-Burman experimental design and results

試驗號X1/次X2/hX3/倍X4/%Y1/mgY2/mgY3/%試驗號X1/次X2/hX3/倍X4/%Y1/mgY2/mgY3/% 1131560116.2316.288.557331540149.7321.3712.75 21184056.884.405.0983184099.6614.779.51 333860159.7214.1011.90913154082.7712.367.70 411156089.1916.657.02103186091.4412.628.28 51384090.128.427.11111186032.297.254.09 6311540132.9624.4210.951233860133.9719.2810.69

表3 方差分析

Table 3 Analysis of variance

誤差來源自由度Y1Y2Y3 離均方平均和均方F值P值離均方平均和均方F值P值離均方平均和均方F值P值 模型412 592.7003 148.1807.6600.011257.78064.4453.8200.0597.036×10?31.759×10?318.2400.001 線性412 592.7003 148.1807.6600.011257.78064.4453.8200.0597.036×10?31.759×10?318.2400.001 X117 500.0007 500.00018.2500.004141.453141.4538.3900.0235.010×10?35.010×10?351.9600.000 X214 412.9004 412.93010.7400.01411.40711.4070.6800.4381.578×10?31.578×10?316.3600.005 X31670.200670.2101.6300.242104.903104.9036.2200.0413.920×10?43.920×10?44.0700.084 X419.6009.5800.0200.8830.0160.0160.0000.9765.500×10?55.500×10?50.5800.473 誤差72 877.400411.060 117.98816.855 6.750×10?49.600×10?5 合計11375.768 375.768 7.711×10?3

圖3 標準化效應的pareto圖(響應為綜合評分, α = 0.05)

2.5 北劉寄奴-骨碎補提取工藝的確定和驗證

運用Box-Behnken實驗所得結果，采用Monte Carlo法獲取基于達標概率的設計空間，設定計算機模擬10 000次，計算步長為0.02，達標概率為0.9可以獲得較為穩(wěn)定可靠的結果[34-35]。建立設計空間，采用Matlab（2016b）軟件提供的Monte Carlo仿真法計算獲得北劉寄奴-骨碎補提取工藝參數的設計空間圖（圖4）。

表4 Box-Behnken試驗設計與結果

Table 4 Box-Behnken experimental design and results

編號X1/次X2/hX3/倍Y1/mgY2/mgY3/% 122.08.0218.1224.178.68 222.015.0296.8035.3710.66 332.011.5386.2440.9212.27 421.08.0231.1721.428.08 521.511.5294.8326.139.56 631.515.0373.3940.7311.94 711.011.5132.3515.615.59 821.015.0266.7630.129.24 921.511.5260.9128.689.82 1021.511.5279.0325.129.58 1112.011.5187.6521.197.12 1211.515.0189.3721.787.53 1321.511.5278.6929.669.26 1411.58.0127.5413.255.55 1531.58.0267.4423.4010.41 1621.511.5280.2225.639.37 1731.011.5309.8524.499.20

在最佳提取工藝范圍分別選取點內（?1，0.9，?0.9）、點外（?0.9，0.94，?0.78）平行進行2組實驗，測定柚皮苷量、木犀草素量、干膏率，結果表明點內A的各項指標及綜合評分均優(yōu)于點外B，驗證結果見表5。從驗證結果可得該模型具有較好的預測能力，且在設計空間內操作能保證提取液質量的穩(wěn)定性。

圖4 北劉寄奴-骨碎補提取工藝設計空間圖

表5 設計空間結果驗證

Table 5 Verification of design space results

編號X1/次X2/minX3/倍Y1/mgY2/mgY3/%綜合評分 1211610127.7826.399.8199.99 2211610126.0418.039.5686.27 31114976.5715.196.3860.01 41114979.0413.015.9556.60

3 討論

目前多數提取工藝研究采用1個或多個化學成分作為指標成分，但這些成分是否為其有效成分并未得到充分的研究，只是引用文獻進行說明。本實驗在提取工藝選擇指標時，采用網絡藥理學對處方治療AS的成分進行篩選確定，再結合文獻和《中國藥典》2020年版一部相關北劉寄奴、骨碎補藥材項下的指標性成分，最終選取木犀草素、柚皮苷為本研究中的指標性成分。

本研究基于質量來源于設計理念，以北劉寄奴-骨碎補提取工藝為例建立其設計空間，選取柚皮苷、木犀草素和干膏率作為關鍵評價指標，采用設計空間法研究工藝與質量參數的關聯(lián)性，通過文獻研究和前期實驗確定提取次數、提取時間、乙醇體積分數、加溶媒倍數為影響北劉寄奴-骨碎補提取過程的CPP，對結果進行方差分析，結果表明提取次數、提取時間、加溶媒倍數對提取工藝影響較大。通過Box-Behnken實驗設計探究CPP和CQA的相關性，采用Monte Carlo法進行模擬計算，最終得到北劉寄奴-骨碎補提取工藝參數操作空間為提取次數3次，每次提取時間2～3 h，加溶媒倍數為11～15倍，乙醇體積分數為45%。經驗證設計空間內選取的點的各項指標均優(yōu)于設計空間外，驗證結果與預測結果基本一致，大生產中采用設計空間法達到工藝可調的目的，在中藥原藥材質量波動較大的情況下也能最終保證中藥制劑質量穩(wěn)定可控[16]。

近年來，世界各國都在提倡低碳經濟，隨著我國醫(yī)藥市場的快速開發(fā)和國際市場對天然產物需求的持續(xù)增長，中藥產業(yè)將成為我國藥品行業(yè)經濟發(fā)展中心之一，中藥材的提取在傳統(tǒng)工藝過程中，多采用單因素實驗和正交實驗進行工藝優(yōu)化，并采取固定的提取工藝參數進行生產，可能存在過度提取的弊端，導致產品質量不同批次或同一批次間波動范圍較大[36]。而設計空間的建立，則是對原料藥材提取工藝范圍進行確定，可以根據生產設備條件、原料藥材的質量以及不同的環(huán)境在設計空間范圍內對工藝參數進行調節(jié)，保證中間體、最終產品的質量穩(wěn)定性[37]。同時，將進一步提高工藝參數與產品質量之間的關聯(lián)性，保證產品同一批次產品質量一致性，做到安全有效、均一可控[38]。除此之外，設計空間的建立提高了重要分析方法的耐用性，分析多個變量間的相互作用，減少了提取時間、能源消耗[39]，從而可能降低碳排放量、提高生產效率、降低生產成本，推動低碳經濟發(fā)展。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Optimization of extraction technology of-based on design space method

ZHANG Mei1, KUANG Gang2, ZHANG You-jin3, LEI Yan-li4, TAN Yao-lin5, YU Zhi-qing4, DUAN Si-yang4, LIU Tao1, 6

1. School of Food and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China 2. School of Biological and Chemical Engineering, Chongqing Second Normal University, Chongqing 400047, China 3. Clinical Medical College, Chengdu University, Chengdu 610081, China 4. College of Pharmacy, Chengdu University, Chengdu 610106, China 5. School of Pharmacy, Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530200, China 6. Sichuan Provincial Engineering Research Center for Antiviral Chinese Medicine Industrialization, Chengdu 610106, China

To optimize the extraction process of Beiliujinu (, SH)-Gushibu (, DR) by network pharmacology and design space method, determine the range of extraction process parameters, improve the utilization rate of raw medicinal materials and reduce energy consumption, so as to reduce carbon emissions and protect the environment.The active components were screened by network pharmacology, and naringin and luteolin were determined as the index components under the relevant items of “” 2020 edition. The Plackett-Burman experimental design was carried out by Minitab 17 software. The extraction times, extraction time and solvent multiple were preliminarily determined as the critical process parameters (CPP). The Box-Behnken three-factor three-level experimental design was carried out by software Design-Expert 10, and the mathematical model between the critical quality attribute (CQA) and CPP was established. Finally, the probability-based design space was obtained by Monte Carlo method, and the interior and exterior points were verified.The optimal extraction process was determined as follows: ethanol concentration 45%, extraction three times, extraction time 2—3 h each time, and solvent multiple 11—15 times.The verification results show that the theoretical value obtained by using the design space method to optimize the extraction process of SH-DR is close to the predicted value, indicating that the method is stable and reliable, which can avoid the potential excessive extraction drawbacks of conventional design methods, and can save resources and reduce carbon emissions in mass production.

network pharmacology; design space method;;; naringin; luteolin; Plackett-Burman experimental design; critical process parameters; critical quality attribute; Monte Carlo method

R284.2

A

0253 - 2670(2022)08 - 2341 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.010

2021-10-30

四川省科技創(chuàng)新苗子工程資助項目（2021054）；2021年四川省大學生創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（S202111079126X）；2021年四川省大學生創(chuàng)新訓練計劃項目（S202111079087）；四川省2021—2023年高等教育人才培養(yǎng)質量和教學改革項目（JG2021-1106）

張 梅（2001—），在讀本科生，研究方向為中藥新藥開發(fā)研究。Tel: 18381355193 E-mail: 2523016935@qq.com

劉 濤（1976—），博士，教授，主要從事中成藥新藥開發(fā)及再評價工作。Tel: 13378118375 E-mail: liutao0578@sina.com

[責任編輯 鄭禮勝]