楊帆 零雅茗 舒紅 姜生偉 王佳楠 李丹蕾

摘 要：為探究Bx-TIMP基因在松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）致病過程中的功能，對(duì)Bx-TIMP基因進(jìn)行克隆及分析，并驗(yàn)證基因沉默后松材線蟲致病性變化。PCR法克隆Bx-TIMP，應(yīng)用TMHMM 2.0 server和SignalP 4.1 Server分析該基因編碼蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽;應(yīng)用原位雜交技術(shù)確定該基因在松材線蟲體內(nèi)表達(dá)部位;應(yīng)用RNAi技術(shù)，分析沉默該基因后松材線蟲對(duì)紅松（Pinus koraiensis）致病性變化。該基因CDS區(qū)全長(zhǎng)363 bp，編碼120個(gè)氨基酸，編碼蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)域及信號(hào)肽。原位雜交表明該基因在松材線蟲食道腺中表達(dá)。基因沉默后，松材線蟲對(duì)紅松致病性減弱。結(jié)果表明，Bx-TIMP為效應(yīng)因子基因，與松材線蟲致病性相關(guān)。本研究揭示Bx-TIMP基因是松材線蟲危害松樹致使其發(fā)病的關(guān)鍵基因，為進(jìn)一步明確松材線蟲致病機(jī)理提供理論依據(jù)，為研發(fā)松材線蟲的防治技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：松材線蟲;致病性;效應(yīng)因子;紅松;基因沉默

中圖分類號(hào)：S763.18??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A?? 文章編號(hào)：1006-8023（2022）02-0014-06

Cloning and Functional Analysis of Bursaphelenchus xylophilus Bx-TIMP

YANG Fan1，2， LING Yaming1，2，5， SHU Hong3， JIANG Shengwei3，4， WANG Jianan1，2， LI Danlei1，2，4*

（1.School of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China; 2.Key Laboratory of Alien Forest

Pest Monitoring and Control - Heilongjiang Province， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China;

3.Liaoning Provincial Station of Forest and Grassland Pest Control and Quarantine， Shenyang

110001， China; 4.Liaoning Provincial Key Laboratory of Dangerous Forest Pest Management

and Control， Shenyang Institute of Technology， Shenyang 113122， China; 5.Shiwandashan

National Nature Reserve Administration， Fangchenggang 535500， China）

Abstract：To explore the function of the gene Bx-TIMP during Bursaphelenchus xylophilus infecting Pinus sp.， Bx-TIMP was cloned and analyzed， then the gene was silenced by RNAi and vitrificated. The transmembrane domain and signal peptide of the protein encoded by Bx-TIMP was analyzed by TMHMM 2.0 server and SignalP 4.1 Server. The expression site of the gene in B. ylophilus was determined by in-situ hybridization. By silencing the gene with RNAi， the pathogenicity of B. xylophilus to P. koraiensis was analyzed. The gene had a total length of 363 bp and encoded 120 amino acids. The protein encoded by Bx-TIMP had a transmembrane domain and signal peptide and the results of in-situ hybridization showed that the gene was expressed in the esophageal gland of B. xylophilus， which accorded with the characteristics of effectors. The symptoms of P. koraiensis in Bx-TIMP-RNAi group were significantly weaker than those in the control group. This study showed that Bx-TIMP was an effector gene， which was related to the pathogenicity of B. xylophilus. This study revealed that Bx-TIMP gene is the key gene of B. xylophilus endangering pine trees， which provided a theoretical basis for further clarifying the pathogenesis of B. xylophilus and laying a theoretical foundation for the development of control technology of B. xylophilus.

Keywords：Bursaphelenchus xylophilus; pathogenicity; effect factor; Pinus koraiensis; RNAi

0 引言

與寄主互作時(shí)，病原分泌效應(yīng)因子抑制寄主模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識(shí)別病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）而觸發(fā)的先天免疫，促進(jìn)病原成功侵染寄主。植物寄生線蟲（plant parasitic nematodes，PPNs）通過口針將食道腺體分泌的效應(yīng)因子導(dǎo)入寄主細(xì)胞中，以完成寄生過程并從寄主細(xì)胞中獲取營(yíng)養(yǎng)。效應(yīng)因子有助于線蟲在寄主體內(nèi)成功取食、繁殖和遷移，促進(jìn)線蟲侵染和寄生。目前，線蟲效應(yīng)因子的研究大都集中在固著性內(nèi)寄生線蟲：胞囊線蟲（Heterodera sp.）和根結(jié)線蟲（Meloidogyne sp.）中。

松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）是引起松樹萎蔫?。╬ine wilt disease，PWD）的一種遷徙性內(nèi)寄生線蟲。松樹萎蔫病是對(duì)松樹極具破壞性的病害之一，導(dǎo)致每年約500萬(wàn)m3的木材損失。在中國(guó)，松材線蟲最早于1982年在南京中山陵發(fā)現(xiàn)。松材線蟲與寄主植物的互作是由食道腺分泌的效應(yīng)因子介導(dǎo)的，一些已知的效應(yīng)因子可以修飾寄主植物的細(xì)胞，促進(jìn)松材線蟲營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝入以維持生長(zhǎng)和發(fā)育，還有一些效應(yīng)因子可以改變寄主植物的信號(hào)通路，抑制植物的防御反應(yīng)。對(duì)松材線蟲效應(yīng)因子的研究對(duì)了解寄生機(jī)制和開發(fā)新的松材線蟲的防治措施具有重要意義。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析篩選到效應(yīng)因子組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）基因Bx-TIMP。TIMPs是一個(gè)保守的蛋白家族，是基質(zhì)蛋白的特異性抑制劑，主要有4種亞型（TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4）。TIMPs整體呈楔形，可直接與MMPs的活性間隙1∶1結(jié)合發(fā)揮效應(yīng)，調(diào)節(jié)MMPs的活性，其N端和C端結(jié)構(gòu)域分別由125和65個(gè)氨基酸構(gòu)成，每個(gè)氨基酸都包含3個(gè)保守的二硫鍵，其中N端結(jié)構(gòu)域的單獨(dú)單元折疊是發(fā)揮抑制MMPs效應(yīng)的主要結(jié)構(gòu)。哺乳動(dòng)物TIMPs已被證明在體外和器官培養(yǎng)系統(tǒng)中負(fù)調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，也負(fù)調(diào)控體外聚蛋白多糖酶的活性。目前，尚未見松材線蟲TIMPs研究報(bào)道。本研究探究Bx-TIMP基因在松材線蟲致病過程中的功能，為進(jìn)一步明確松材線蟲致病機(jī)理提供理論依據(jù)，為研發(fā)松材線蟲的防治技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 Bx-TIMP基因克隆及分析

Trizol法提取松材線蟲總RNA，并通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得松材線蟲cDNA。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)涵蓋Bx-TIMP完整編碼蛋白區(qū)（coding sequence，CDS）的PCR引物，（Bx-TIMP-F序列：5′-CGCGAAAATCGTCAACCTCG-3′;Bx-TIMP-R序列：5′-GCGGTGCTGTTCAATTCCTC-3′）以植食松材線蟲cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，克隆后的基因產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

應(yīng)用TMHMM 2.0 server對(duì)Bx-TIMP編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)，應(yīng)用SignalP 4.1 Server進(jìn)行Bx-TIMP信號(hào)肽分析。

1.2 Bx-TIMP原位雜交

提取含有相應(yīng)目的片段的質(zhì)粒，應(yīng)用Roche DIG RNA Labeling Kit （SP6/T7）分別合成正義及反義RNA探針。應(yīng)用DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I （Roche）進(jìn)行雜交及信號(hào)檢測(cè)。將雜交顯影后制成的玻片置于Olympus BX51顯微鏡下拍照。

1.3 Bx-TIMP RNAi及接種驗(yàn)證

用浸泡法對(duì)松材線蟲進(jìn)行RNAi干擾。準(zhǔn)備10 000條松材線蟲（混合蟲齡），以Bx-TIMP基因的siRNA（5′-AUAUUCCGCAAAGUCCAUCCUCGGC -3′）浸泡處理后，用M9緩沖液清洗回收線蟲，為Bx-TIMP-RNAi組。無(wú)靶基因序列siRNA（5′-AGGAGCUGUUCACCGGGGUGGUGCCCAUCCU -3′）處理的線蟲為CK組。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。應(yīng)用GoTaq2-Step RT-qPCR System試劑盒，分別提取Bx-TIMP-RNAi組及CK組線蟲總RNA進(jìn)行Q-PCR擴(kuò)增（Pri-R：5′-TCTGCCCACTACGGTCTACA-3′;Pri-F：5′-ACCCCCAGTATTTTCATCTCTGA-3′），驗(yàn)證基因沉默效果，兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)差異顯著性。

用Bx-TIMP-RNAi組線蟲、CK組線蟲和ddH2O分別接種于紅松（Pinus koraiensis）3年生松苗，處理后連續(xù)觀察癥狀并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bx-TIMP基因克隆及結(jié)構(gòu)域分析

TRIzol法提取松材線蟲總RNA，0.8%凝膠電泳檢測(cè)RNeasy Minikit column（Qiagen， cat. No. 74 104）純化后的RNA如圖1（a）所示，純度由BioPhotometer D30（Eppendorf， Hamburg， Germany）鑒定，OD值（OD260/OD280=1.9，OD260/OD230>1.7）符合要求。

以植食線蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物TA克隆后獲得基因產(chǎn)物送由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序得到Bx-TIMP基因片段長(zhǎng)度363 bp，如圖1（b）所示。

在NCBI（National Center for Biotechnology Information）中比對(duì)同源序列，如圖1（c）所示，篩選到12條同源序列的保守結(jié)構(gòu)域分析均為TIMP結(jié)構(gòu)域，如圖1（d）所示。以擬禾本科根結(jié)線蟲（Meloidogyne graminicola）為內(nèi)參，方頭恐猛蟻（Dinoponera quadriceps）為外參，以這12條同源序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1（e）所示。

進(jìn)一步對(duì)該基因信號(hào)肽及結(jié)構(gòu)域進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，Bx-TIMP編碼的蛋白質(zhì)具有信號(hào)肽（圖2（a））和跨膜結(jié)構(gòu)域（圖2（b）），均符合效應(yīng)因子特征。

2.2 Bx-TIMP原位雜交

原位雜交結(jié)果顯示在線蟲食道腺上檢測(cè)到Bx-TIMP基因信號(hào)標(biāo)記（圖3）。線蟲的食道腺、性腺和側(cè)尾腺是線蟲效應(yīng)因子分泌部位，以食道腺為主， Bx-TIMP原位雜交結(jié)果表示該基因符合線蟲效應(yīng)因子基因表達(dá)特點(diǎn)。

2.3 Bx-TIMP RNAi及接種驗(yàn)證

使用熒光顯微鏡檢測(cè)RNAi組線蟲體內(nèi)由FAM標(biāo)記的dsRNA，松材線蟲通體顯示綠色熒光，表明dsRNA已成功進(jìn)入線蟲體內(nèi)（圖4（a））。Q-PCR檢測(cè)顯示，RNAi組Bx-TIMP基因表達(dá)下調(diào)（圖4（b））說(shuō)明Bx-TIMP基因RNAi效果顯著，CK組無(wú)明顯變化。

根據(jù)接種后紅松發(fā)病情況（圖4（c）），連續(xù)觀察1～33 d，直至33 d觀察結(jié)束，RNAi組癥狀為少數(shù)松樹針葉局部褪綠，病株均仍未完全枯萎死亡。CK組癥狀為所有針葉黃化。ddH2O處理組紅松無(wú)癥狀。

3 結(jié)論與討論

本研究通過克隆TIMPs相關(guān)基因Bx-TIMP并進(jìn)行分析，該基因編碼的蛋白質(zhì)具有跨膜結(jié)構(gòu)域及信號(hào)肽，原位雜交試驗(yàn)表明該基因于松材線蟲食道腺中表達(dá)。將該基因沉默后，松材線蟲對(duì)紅松的致病性降低。因此確定該基因?yàn)樾?yīng)因子基因，該基因編碼的效應(yīng)因子可促進(jìn)松材線蟲侵染松樹。

TIMPs除了抑制MMPs活性還有其他作用，如生長(zhǎng)因子活性、類固醇生成和細(xì)胞形態(tài)調(diào)節(jié)。秀麗線蟲（Caenorhabditis elegans）通過TIMP-1調(diào)節(jié)性腺發(fā)育促進(jìn)其繁殖。Bx-TIMP為組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）基因，可能通過特異性抑制植物基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）活性對(duì)植物防御反應(yīng)產(chǎn)生影響，但該基因影響松材線蟲致病性的作用機(jī)理還需深入研究。本研究通過RNAi技術(shù)沉默該基因后接種紅松驗(yàn)證其功能，Bx-TIMP基因沉默后松材線蟲的致病性降低，表明該基因與松材線蟲致病性有關(guān)，結(jié)合效應(yīng)因子在松材線蟲抑制植物防御反應(yīng)中的重要作用可知，Bx-TIMP在松材線蟲致病性中起關(guān)鍵作用，能夠成為松材線蟲防治的靶標(biāo)基因，有效降低松材線蟲致病性，為松材線蟲的防治提供理論基礎(chǔ)。

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