招雪晴，楊 靜，沈 雨，苑兆和*

(1 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037； 2南京林業(yè)大學 林學院，南京 210037；3 日照市自然資源和規(guī)劃局，山東日照 276800)

石榴(PunicagranatumL.)為千屈菜科(Lythraceae)落葉灌木或小喬木[1]，其果皮、果汁、種子、花和葉中均含有大量的類黃酮化合物[2-5]。類黃酮是廣泛分布在植物體內的次生代謝產物，對植物的生長發(fā)育和人體的營養(yǎng)保健有重要的調節(jié)作用[6-8]。在植物體內，大部分類黃酮通過糖基化反應將糖基(葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖等)轉移到受體分子上[9]，形成多樣的糖苷化合物。糖基化反應由糖基轉移酶(glycosyltransferseas，GTs)催化完成，是植物次生代謝中一種廣泛存在的修飾反應[10-11]。

GTs是一個多成員基因家族，根據底物特異性和催化特性，目前在CAZy數(shù)據庫(Carbohydrate Active enzyme Database)中已鑒定出114個GT家族，其中GT1家族以尿嘧啶核苷二磷酸(Uridine diphosphate，UDP)-糖基轉移酶(UGTs)最為常見。UGTs在糖基化反應中具有底物催化的復雜性和區(qū)域選擇性，為研究類黃酮UGT基因的表達及功能，前人做了大量研究。在獼猴桃[12]、茶樹[13]、銀杏[14]、桑樹[15]、青稞[16]等上的研究表明UGT基因具有表達的組織特異性和時空變化性；而在葡萄[17]、香雪蘭[18]、鳶尾[19]等上的研究表明UGT酶具有催化的分化性和復雜性。雖然石榴中參與類黃酮和花色苷合成的UGT已有報道[20-22]，但UGT家族成員眾多、功能各異，有必要對家族內的其他UGT基因進行挖掘分析。在‘泰山紅’石榴基因組中，有 5個UGT基因可能參與果皮和籽?；ㄉ蘸铣蒣1]，其中，Pg010555.1在果實發(fā)育階段的轉錄豐度最高。本研究以Pg010555.1(PgUGT)為研究對象，在基因克隆基礎上，分析其在果實發(fā)育期的表達模式，初步探討其與類黃酮和花色苷合成的關系；通過構建原核表達載體并轉化大腸桿菌，對其進行原核誘導表達。結果有助于加深對石榴UGT催化特性及類黃酮糖基化機制的認識。

1 材料和方法

1.1 材 料

以南京林業(yè)大學白馬教學科研基地的石榴品種‘泰山紅’為材料。分別于2020年7～9月采集樣品，共劃分為7個采樣時期：7月15日、7月30日、 8月15日、8月30日、9月10日、9月20日和9月30日，分別標記為S1～S7(圖1)。為保證果實發(fā)育狀態(tài)的一致性，采樣時選取生長勢基本一致的植株，在樹冠的東、西、南、北四個方位分別采摘1個果實，運至實驗室后清洗干凈，取果實外果皮，液氮速凍后保存至-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

S1～S7分別代表采樣時期(月-日)： 7-15、7-30、 8-15、8-30、9-10、9-20和9-30；下同

1.2 方 法

1.2.1 石榴PgUGT的全長cDNA克隆采用Biomarker Plant Total RNA Isolation Kit(北京， 百邁克)提取果皮總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳對總RNA進行檢測。使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit(大連，Takara)將RNA反轉錄為cDNA。根據轉錄組UGT序列設計特異引物UGT-F和UGT-R(表1)進行PCR擴增，采用50 μL 的反應體系：2×TaqMaster Mix 25 μL、10 μmol/L 上下游引物各2 μL、50 ng/μL的cDNA模板2 μL，19 μL的ddH2O。PCR反應程序為：95 ℃ 3 min、95 ℃ 30 s、56 ℃ 45 s、72 ℃ 1.5 min、72 ℃ 5 min，35個循環(huán)。PCR產物經回收純化后與pMD-18T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，菌液PCR后選擇陽性克隆送至上海生工生物工程公司測序。

表1 實驗中所用引物

1.2.2 序列分析及系統(tǒng)進化樹構建利用ExPASy網站的ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預測蛋白的分子量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)；利用CDD(Conserved Domain Database)鑒定蛋白結構域；利用DNAMAN進行多重比對。從NCBI下載擬南芥及其他物種的UGT氨基酸序列(表2)，利用MEGA-X對序列進行比對[23]，采用鄰接法(neighbor-joining method)構建系統(tǒng)進化樹，用iTOL軟件[24]對構建的進化樹進行可視化輸出。

表2 用于系統(tǒng)進化樹構建的UGT信息

1.2.3 熒光定量PCR(qRT-PCR)分析分別提取7個時期的石榴果皮總RNA，反轉錄合成第一鏈cDNA，稀釋10倍作為qRT-PCR模板。設計qRT-PCR引物UGT-qF和UGT-qR，以石榴Actin(GU376750)為內參(表1)，采用20 μL反應體系：2 μL的cDNA模板、10 μL MonAmpTMSYBR?Green qPCR Mix (莫納，武漢)、0.4 μL 上游引物和下游引物、7.2 μL Nuclease-free water。PCR程序設置為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。每個PCR反應設3次重復，以7月15日樣品基因表達量為對照，采用2-ΔΔCT法[25]得到每個時期的相對表達量。整個實驗過程重復3次，利用SPSS20對PgUGT相對表達量進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Tukey法進行多重比較(P<0.05)。

1.2.4 總類黃酮及總花色苷含量的測定總類黃酮含量的測定采用常規(guī)AlCl3比色法，略有改動。以蘆丁為標準品得到標準曲線Y=0.013X+0.051 9 (Y為吸光度，X為濃度，R2= 0.999 7)。取0.1 g果皮液氮研磨后加入6 mL 60%乙醇(60∶40，V/V)，超聲提取40 min。離心收集上清。取1 mL上清與3 mL 2.5% AlCl3溶液混合，用60%乙醇稀釋至25 mL，室溫孵育30 min，測定417 nm下的吸光值。根據標準曲線計算總類黃酮含量(mg/g)。所有實驗均為3個重復?？偦ㄉ蘸康臏y定采用前期建立的方法進行[26]。

1.2.5 原核表達根據PgUGT的ORF序列，設計含有酶切切點NdeI和XbaI的特異引物(表1)，擴增并回收PgUGT，用限制性內切酶NdeI和XbaI分別對PCR回收產物和載體pCZN1進行雙酶切，將PCR產物和載體進行連接，連接產物轉化后挑選陽性克隆質粒，經測序鑒定無誤后，重組質粒pCZN1-PgUGT轉化大腸桿菌ArcticExpress感受態(tài)細胞中。挑選單克隆培養(yǎng)過夜，取1 mL菌液轉移到含氨芐青霉素(Amp)的新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃孵育至OD600為0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L，37 ℃誘導4 h。離心收集菌體，用PBS緩沖液重懸，重懸液進行超聲破碎后，離心收集上清和沉淀，產物經12% SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色法檢測蛋白表達情況。

2 結果與分析

2.1 石榴PgUGT基因克隆

PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，目的條帶與預期大小基本一致(圖2)。測序結果經Blast分析后發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列與石榴(Punicagranatum，AHZ97875)、楊梅(Morellarubra，KAB1205527)和美洲葡萄(Vitislabrusca，ABR24135)的相似性分別為94.79%、55.51%和54.44%，表明克隆到的基因為石榴糖基轉移酶家族成員，命名為PgUGT，在GenBank中的登錄號為MW414607。

M. DL2000；1. PgUGT

2.2 生物信息學分析

PgUGT基因開放閱讀框(ORF)長度為1 557 bp，編碼518個氨基酸，C端含有44個保守的氨基酸序列，即PSPG基序(圖3)。編碼的PgUGT蛋白分子量為55.9 kD，等電點為6.55，不穩(wěn)定系數(shù)為42.92，屬于不穩(wěn)定蛋白；平均親水系數(shù)為-0.018小于0，為親水蛋白。CDD保守結構域分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白屬于糖基轉移酶GT-B超家族。

陰影部分為PgUGT蛋白的PSPG保守基序

利用MEGA軟件，將7個石榴UGTs和 45個其他物種UGTs構建系統(tǒng)進化樹。如圖4所示，52個UGT可分為A-N等14個類群，外加PgUGT95B2單獨一組。其中，PgUGT與報道的PgUGT1和PgUGT2聚為一支，構成了UGT家族中的F類群。該組成員主要以類黃酮和苯甲酸衍生物為底物，催化C3位的糖基化。此外，PgUGT和葡萄的VvGT1和草莓的FaGT2親緣關系較近。

具體UGT蛋白序列信息見表2

2.3 果實發(fā)育期內PgUGT表達分析

qRT-PCR結果顯示(圖5)，PgUGT基因在果實發(fā)育期均有表達，在果實發(fā)育前期表達量逐漸升高，在S3時(8月15日)達到峰值，且與其他時期內的表達量具有顯著差異；之后，表達豐度逐漸降低，到后期(9月中下旬)表達量達到最低?？梢姡琍gUGT在果實發(fā)育期內呈現(xiàn)出前高后低的表達模式，表達高峰出現(xiàn)在發(fā)育中期。

不同小寫字母表示基因表達量在各采樣期存在顯著差異(P<0.05)

2.4 總類黃酮及總花色苷含量變化

如圖6所示， ‘泰山紅’石榴果皮中總類黃酮含量隨著時間的推進而不斷降低，在幼果期含量最高，到后期果實成熟時則降至最低；對花色苷來說，其含量整體呈現(xiàn)出波動性上升趨勢，幼果期含量最低，而在后期含量則達到高峰，這與果實紅色不斷積累的表型變化相吻合?？傮w來說，果皮中總類黃酮和總花色苷含量呈現(xiàn)出相反的變化趨勢。

不同小寫字母表示總類黃酮和總花色苷含量在各采樣期存在顯著差異(P<0.05)

2.5 原核表達分析

用限制性內切酶NdeI和XbaI雙酶切鑒定pCZN1-PgUGT重組質粒，酶切片段大小符合預期(圖7)。轉化大腸桿菌ArcticExpress后，挑選陽性克隆搖菌培養(yǎng)，IPTG誘導表達后經SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)在上清中存在一條約58 kD條帶，與pCZN1-PgUGT蛋白的分子量基本一致(約為57 kD)，表明重組質粒在37 ℃誘導下以可溶性形式存在(圖8)。

1. 酶切前；2. 酶切后； M. DL12000

M. 蛋白 Marker；1. 未誘導；2. 誘導后；3. 誘導破碎后上清；4. 誘導破碎后沉淀

3 討 論

由UGT糖基轉移酶催化的糖基化反應是次生代謝產物普遍存在的一種合成后的修飾反應，也是植物體內維持代謝平衡的主要機制之一，決定了次生代謝產物的活性、水溶性、穩(wěn)定性、運輸性及毒性等[10]。本研究對克隆得到的石榴PgUGT進行了qRT-PCR及原核表達分析，研究其表達特性及重組蛋白表達情況，為后續(xù)研究基因功能奠定了基礎。

UGT是一個超基因家族，前人已經從石榴中克隆到了多個UGT基因，如參與花色苷合成的UFGT[20-21]，催化黃酮和黃酮醇糖基化的PgUGT95B2[22]；催化形成沒食子酰葡萄糖苷的UGT81A23和UGT84A24[27]；催化沒食子酸形成沒食子酸葡萄糖苷的UGT72BD1[28]。本研究克隆的PgUGT氨基酸序列具有糖基轉移酶的保守PSPG基序，表明其屬于糖基轉移酶基因家族。系統(tǒng)進化樹分析將其劃分到UGT家族的F組中，該組成員多數(shù)具有催化類黃酮糖基化的功能，且糖基化修飾的位點是C3，如草莓的FaGT2[29]、擬南芥的AtUGT78D2[30]、 香雪蘭的Fh3GT1[31]等。根據序列比對及進化樹分析結果，推測PgUGT為類黃酮3-O-糖基轉移酶基因。

qRT-PCR結果表明該基因在果實發(fā)育前期表達量較高，隨著果實的發(fā)育其轉錄豐度下降，在果實發(fā)育成熟的后期基因表達量處于較低水平。黑莓(Rubusspp.)的糖基轉移酶基因UGT78H2具有類似的表達模式，其在幼果期表達量最高，后期較低[32]。通過與PgUFGT(KF841620)在‘紅寶石’石榴的表達模式相比較[20]，發(fā)現(xiàn)在取材時間內兩者的表達趨勢類似，表明兩基因可能都參與了石榴類黃酮物質的糖基化反應。前期的轉錄組分析表明，PgUGT在‘泰山紅’果皮和籽粒中皆為高表達，且在4個發(fā)育階段中表達量差異不大[1]，這與本研究結果有較大差異，這可能來源于取材的時間差異，或轉錄組測序數(shù)據以reads為表達量產生的分析差異。進一步分析發(fā)現(xiàn)，PgUGT在果實發(fā)育期內前高后低的表達模式與花色苷含量不斷升高、類黃酮不斷下降的積累模式不完全吻合，這種基因表達與物質合成不一致的現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在香雪蘭Fh3GT1[31]、百日草Ze3GT[33]的研究中。因此，我們推測可能還有另外的糖基轉移酶參與石榴類黃酮或花色苷的合成，或者PgUGT同時參與了類黃酮和花色苷的糖基化反應過程。

目前一般有3種方法表征UGTs的催化功能，包括突變體分離克隆、基因克隆并酶學特性分析、異源探針篩選cDNA文庫獲得目標基因[34]。對于UGT的催化機制和生物學功能研究大都通過以大腸桿菌為代表的原核表達系統(tǒng)和以酵母為代表的真核表達系統(tǒng)進行。其中，原核表達系統(tǒng)具有產量高、穩(wěn)定性好、易操作等優(yōu)點，是目前大多數(shù)UGTs功能研究的主要途徑。因此，本研究構建了PgUGT的重組表達載體pCZN1-PgUGT，并對其進行了誘導表達。在原核表達體系中，類黃酮UGT融合蛋白或者在上清中表達[35-36]，或者以包涵體的形式存在[32, 37]。蛋白聚集成的包涵體為無生物活性的不可溶沉淀，后續(xù)還需進行變性、復性等操作進行純化，成為原核表達系統(tǒng)廣泛應用的限制因素。本研究中在37 ℃誘導4 h條件下PgUGT目的蛋白以可溶性形式存在，這有助于后續(xù)的研究。

綜上，本研究從石榴中獲得了一個類黃酮糖基轉移酶PgUGT，其表達量在果實發(fā)育過程中呈現(xiàn)先升后降的趨勢，與總類黃酮含量的逐漸下降和總花色苷含量的逐漸上升趨勢不同。原核表達結果顯示重組質?？稍诖竽c桿菌中可溶性表達。該結果為進一步研究PgUGT的功能及其在石榴類黃酮糖苷化反應中的作用奠定了理論基礎。