來歡歡,張凱悅,田青,董晉文,趙微,崔美林,張秀紅*

1(山西師范大學 生命科學學院,山西 太原,030031) 2(山西師范大學 食品科學學院,山西 太原,030031)

自溶酶是細菌合成用以降解細胞壁肽聚糖的酶類,也稱肽聚糖水解酶(peptidoglycan hydrolase,PGH)[1-2]。細菌快速生長時,合成的自溶酶作用于細胞壁肽聚糖形成孔洞和縫隙[3-4],可插入新合成的肽聚糖使細胞體積增大,自溶酶還有助于子細胞的分離[5],在細菌生長繁殖中起作用。此時,只有細胞壁特定部位肽聚糖限定程度的水解,保證細胞的正常生長,才不會合成過多的自溶酶導致細胞裂解死亡,因此,自溶酶的活性需要極為精準的調(diào)控[6]。在細菌進入衰亡期時也會合成PGH以及其他水解酶類,在細菌細胞程序性死亡中起作用。細菌細胞壁肽聚糖是由糖鏈、肽尾和肽橋組成的單體連成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[7],為了精確控制肽聚糖的水解,細菌細胞往往編碼多種PGH,如N-乙酰葡萄糖苷糖胺酶,N-乙酰胞壁質(zhì)酶、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、內(nèi)肽酶和羧肽酶以及轉(zhuǎn)糖基酶[8]。

乳酸菌是一類重要的益生菌,在多種發(fā)酵食品生產(chǎn)中都需要其大量生長繁殖以發(fā)揮作用[9-10]。但有時也需要控制乳酸菌的生長,如酸奶后熟過程中需要抑制乳酸菌的生長[11-12],以減少酸度的增加及過多的乳清形成。在白酒釀造過程中,乳酸菌產(chǎn)生乳酸,降低酒醅pH,促進酒精發(fā)酵順利進行,而且乳酸及其酯化形成的乳酸乙酯均是白酒的重要風味物質(zhì)[13],乳酸菌在白酒釀造中起到重要作用。但是,每年春末夏初酒醅中的乳酸菌大量增殖會導致乳酸過量,既降低新酒產(chǎn)量,過多的乳酸乙酯又改變了新酒主體風味物質(zhì)比例,影響了新酒質(zhì)量[14],是白酒生產(chǎn)中亟需解決的問題。本文以酒醅來源的高自溶度L.plantarumSL32-2為研究對象,考察其自溶酶的酶學性質(zhì)及底物特異性,為白酒生產(chǎn)過程中乳酸菌的控制提供新的思路和策略。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

菌株：LactobacillusplantarumSL32-2從某清香型白酒廠地缸上層酒醅中分離(本實驗室保存)。

主要試劑：MRS培養(yǎng)基,生物試劑,北京奧博星生物技術(shù)責任有限公司;KH2PO4、LiCl、MgCl2,均為分析純,天津科密歐化學試劑有限公司;馬脲酰-L-苯丙氨酸、對硝基乙酰苯胺、牛血紅蛋白、對硝基苯胺,均為分析純,上海宇淳生物科技有限公司;二硝基水楊酸、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA),均為分析純,天津市光復科技發(fā)展有限公司;檸檬酸，分析純,天津市風船化學試劑科技有限責任公司;NaOH、苯酚,均為分析純,洛陽市化學試劑廠。

DNS試劑：酒石酸鉀鈉18.2 g,溶于50 mL蒸餾水中,加熱,于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸0.03 g,NaOH 2.1 g,苯酚0.5 g,攪拌至完全溶解。

茚三酮試劑：稱取茚三酮1 g于盛有35 mL熱水的燒杯中使其溶解,加入40 mg氯化亞錫,攪拌過濾(作防腐劑)。濾液置冷暗處過夜,加水至50 mL,搖勻備用。

LiCl-Tris(pH 8.0)緩沖液：配制0.05 mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0),加入0.01 mmol/L MgCl2和0.001 mmol/L EDTA,待溶解后,加入1 mol/L LiCl,放入4 ℃冰箱保存。

1.2 儀器與設備

GI80DS高溫滅菌鍋,致微(廈門)儀器有限公司;PHS-3C型酸度計,上海儀電科學儀器股份有限公司;ZHJH-C1112B智城超凈工作臺、ZXMP-R1230恒溫恒濕培養(yǎng)箱,上海智城分析儀器制造有限公司;KQ-3OOE型超聲波清洗機,昆山市超聲儀器有限公司;可見分光光度計,上海美譜達儀器有限公司;D-37520低速冷凍離心機,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;電熱鼓風干燥箱,上海一恒科學儀器有限公司;Microfuge 20R高速冷凍離心機,貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司。

1.3 試驗條件

1.3.1 菌株的活化

將L.plantarumSL32-2接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 生長曲線繪制與自溶度測定

生長曲線繪制：將活化后的L.plantarumSL32-2以2%(體積分數(shù),下同)的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng),定期取樣測OD650 nm值。

自溶度測定[15]：與生長曲線繪制時同時取樣,離心(4 500 r/min,10 min,4 ℃)收集菌體,無菌水洗滌2次,重懸于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)(50 mmol/L,pH 6.5),取部分樣品測定初始OD650 nm,讀數(shù)記為A0,剩余樣品置于37 ℃繼續(xù)溫育72 h后,測定OD650 nm,讀數(shù)記為At,自溶度計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.3 自溶酶的制備

將活化的L.plantarumSL32-2以2%的接種量接種于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)4 h后,離心(4 500 r/min,10 min,4 ℃)收集菌體,并用無菌水洗滌2次,懸浮于1 mL濃度為1 mol/L LiCl的抽提液中,4 ℃靜置1 h,離心(12 000×g,15 min,4 ℃)收集上清液,經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾后即自溶酶粗酶液[16]。

1.3.4 自溶酶作用底物的提取

將活化后的L.plantarumSL32-2以2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)4 h后,離心(4 500 r/min,10 min,4 ℃)收集菌體,然后用無菌水洗滌2次后,4 ℃保藏備用。

1.3.5 自溶酶活性檢測

將自溶酶粗酶液加入到底物乳酸菌PBS中,調(diào)整菌液吸光值為0.3左右,記為A0,將乳酸菌PBS調(diào)整到相同的吸光度值作為對照。在37 ℃恒溫條件下分別反應2、4 h后測OD600 nm,自溶酶處理組記為A1,對照組記為A2,自溶酶的活性計算如公式(2)所示[17]：

(2)

1.3.6 底物特異性

還原糖含量測定用DNS法,具體參考王明瑞等[18]的方法。氨基酸含量測定用茚三酮比色法,具體參考鄧湘波等[19]的方法。

β-N-乙酰-葡萄糖胺酶活性測定：以對硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷為顯色底物,3 mL的反應體系中加入0.9 mL的PBS(0.1 mol/L,pH 7.0),0.1 mL底物溶液(1 mmol/L),2 mL酶液,37 ℃反應6 h,410 nm處檢測釋放的對硝基苯胺。酶活力單位(U)定義為：在最適條件下,每小時生成1 μmol對硝基苯胺所需要的酶量為1個酶活力單位[20]。

乙酰胞壁酰胺酶活性測定：以對硝基乙酰苯胺為底物,3 mL的反應體系中加入0.9 mL的PBS(0.1 mol/L,pH 7.0),0.1 mL 1 mmol/L底物溶液,2 mL酶液,37 ℃反應6 h,410 nm處檢測釋放的對硝基苯胺。酶活力單位(U)定義為：在最適條件下,每小時生成1 μmol對硝基苯胺所需要的酶量為1個酶活力單位[21]。

內(nèi)肽酶活性測定：以牛血紅蛋白為底物,3 mL反應體系中加入0.4 mL的檸檬酸緩沖液(pH 4.8)和0.2 mL檸檬酸緩沖液(pH 4.8)配制的1%(質(zhì)量分數(shù))的牛血紅蛋白,38 ℃保溫10 min后,加2.4 mL酶液,38 ℃下反應1 h,然后加入1 mL質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯乙酸終止反應(對照管在反應前加三氯乙酸),4 ℃下靜止30 min后,離心(4 500 r/min,5 min,4 ℃),上清液用于茚三酮反應,測定單位蛋白質(zhì)生成的氨基酸。酶活力單位(U)定義為：在最適條件下,每小時生成1 μmol氨基酸所需要的酶量為1個酶活力單位[22]。

羧肽酶活性測定：以馬脲酰-L-苯丙氨酸為底物,3 mL反應體系中加入0.4 mL的檸檬酸緩沖液(pH 4.8),0.2 mL的檸檬酸緩沖液(pH 4.8)配制的質(zhì)量分數(shù)為0.3%的馬脲酰-L-苯丙氨酸,38 ℃保溫10 min后,加2.4 mL酶液,38 ℃下反應1 h,然后加入1 mL質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯乙酸終止反應(對照管在反應前加三氯乙酸),4 ℃下靜止30 min后,離心(4 500 r/min,5 min,4 ℃),上清液用于茚三酮反應,測定單位蛋白質(zhì)生成的氨基酸量。酶活力單位(U)定義為：在最適條件下,每小時生成1 μmol氨基酸所需要的酶量為1個酶活力單位[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 L.plantarum SL32-2的生長曲線和自溶度曲線

L.plantarumSL32-2的生長曲線和自溶度曲線如圖1所示?；罨蟮腖.plantarumSL32-2在MRS液體培養(yǎng)基中生長迅速,延滯期較短約為2 h,對數(shù)生長期為2～20 h,之后進入穩(wěn)定期,OD650 nm可達5.08,40 h后進入衰亡期。圖1中自溶度曲線表明,L.plantarumSL32-2在培養(yǎng)4 h有1個自溶度高峰,自溶度高達46%,此時菌株正處在對數(shù)早期,之后自溶度迅速下降,在15%～20%波動,整體變化趨勢與乳酸菌LB-3自溶酶的變化趨勢一致[23]。說明在對數(shù)早期,乳酸菌自溶酶活性較高,在細胞壁肽聚糖上形成大量縫隙以填充新的肽聚糖,使菌體快速生長繁殖。在進一步分析L.plantarumSL32-2自溶酶的特性時,取對數(shù)早期4 h的發(fā)酵液提取自溶酶。

圖1 L.plantarum SL32-2的生長曲線及自溶度曲線Fig.1 Growth curve and autolysis rate of L.plantarum SL32-2

2.2 反應體系對L.plantarum SL32-2自溶酶活性的影響

為進一步了解L.plantarumSL32-2自溶酶在胞外的活性,以該菌細胞作為底物,與自溶酶在不同反應體系混合后測定自溶酶活性,自溶酶活性用OD600 nm下降百分率表示,結(jié)果見圖2。在不同的反應體系中,反應時間為2 h時,OD600 nm下降百分率最大,表明在該時間段內(nèi)自溶酶的活性最高,之后OD600 nm下降百分率變化緩慢,因此,在后續(xù)試驗中選取2 h作為反應時間。同時,隨著自溶酶比例升高,OD600 nm下降百分率增大,表明自溶酶的活性有所提高,當反應體系為V(底物乳酸菌)∶V(自溶酶)=1∶2時,自溶酶活性最高,OD600 nm下降百分率可達23.33%。在后面的試驗中選擇V(底物乳酸菌)∶V(自溶酶)=1∶2進行。

圖2 反應體系對L.plantarum SL32-2自溶酶活性的影響Fig.2 Effect of reaction systems on the autolysin activity of L.plantarum SL32-2

2.3 溫度對L.plantarum SL32-2自溶酶活性的影響

乳酸菌自溶酶可能是多種組分體系,因為常以混合形式應用,仍需明確其自溶酶體系的酶學性質(zhì)。為了解L.plantarumSL32-2自溶酶體系的最適溫度,試驗于27、32、37、42、47 ℃下檢測自溶酶活性,結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度對L.plantarum SL32-2自溶酶活性的影響Fig.3 Effect of temperature on the autolysin activity of L.plantarum SL32-2注：不同字母表示差異性顯著,P<0.05(下同)

隨著溫度的升高,自溶酶的活性呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢,之后自溶酶活性基本趨于穩(wěn)定,37 ℃時,自溶酶的活性最高,OD600 nm下降百分率為16.28%;之后自溶酶活性開始下降,42 ℃、47 ℃時OD600 nm下降百分率分別為14.47%和14.08%。從干酪中分離的LactobacilluscaseiBL23中提取的N-乙酰胞壁酸酶AclB最適溫度為37 ℃,與本試驗結(jié)論一致[17]。

2.4 pH對L.plantarum SL32-2自溶酶活性的影響

為進一步了解L.plantarumSL32-2自溶酶的最適pH,在pH值為 5.5、6.5、7.5及8.5的條件下檢測自溶酶活性,結(jié)果如圖4所示。隨著pH的升高,L.plantarumSL32-2自溶酶的活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,當pH為7.5時,自溶酶的活性最高,OD600 nm下降百分率為26.7%;當pH>7.5,自溶酶活性開始降低,pH為8.5時OD600 nm下降百分率為21.48%。從意大利臘腸中分離的Lactobacillussakei中提取的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶最適pH為8.0,與本試驗結(jié)果比較接近[24]。

圖4 pH對L.plantarum SL32-2自溶酶活性的影響Fig.4 Effect of pH on the autolysin activity of L.plantarum SL32-2

2.5 L.plantarum SL32-2自溶酶底物特異性分析

乳酸菌與金黃色葡萄球菌的肽聚糖結(jié)構(gòu)類似,糖鏈均由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通過β-1,4糖苷鍵交替連接而成;乳酸菌肽聚糖的四肽尾是-L-丙氨酸-2-γ-D-谷氨酸-3-X-4-D-丙氨酸,其中的X可能是L-賴氨酸(L-Lys)、內(nèi)消旋二氨基庚二酸(mDAP)或L-鳥氨酸(L-Orn),肽橋可以由1條四肽尾的第4位氨基酸與另1條四肽尾的第3位氨基酸交聯(lián)形成,也可以通過1個D-氨基酸或多個L-氨基酸連接形成[25],可見,乳酸菌肽聚糖多樣性表現(xiàn)在肽橋和肽尾。肽聚糖復雜結(jié)構(gòu)使得細菌可編碼多個PGH。為了解L.plantarumSL32-2自溶酶的底物特異性,在有無外加自溶酶的條件下,比較自溶前后緩沖液中的還原糖和氨基酸含量變化,判斷是否有切斷糖鏈和肽鏈的酶類,并同時檢測自溶度。從圖5中可以看出,L.plantarumSL32-2自溶前還原糖為1.59 mg/mL,自溶后增加到2.38 mg/mL,增加了0.50倍,說明L.plantarumSL32-2自溶酶可降解肽聚糖糖鏈部分;添加自溶酶后還原糖質(zhì)量濃度由自溶前的1.49 mg/mL,增加到自溶后的3.06 mg/mL,增加了1.05倍,L.plantarumSL32-2的自溶度在添加自溶酶后也由17.21%增加到29.25%(圖6),說明自溶酶在胞外顯著促進了乳酸菌的自溶。L.plantarumSL32-2自溶前氨基酸為0.041 mg/mL,自溶后增加到1.101 mg/mL,增加了25.83倍,說明L.plantarumSL32-2自溶酶可降解肽聚糖的肽鏈部分;添加自溶酶后氨基酸由自溶前的0.040 mg/mL,增加到自溶后的1.753 mg/mL,增加了42.83倍,再次說明自溶酶在胞外顯著促進了乳酸菌的自溶。由上可知,無論是否外加自溶酶,自溶后氨基酸增加量都遠大于還原糖,證明作用于肽尾和肽橋的自溶酶組分活性更高。

圖5 添加自溶酶對L.plantarum SL32-2自溶前后還原糖和氨基酸變化量的影響Fig.5 Effect of adding autolysin on the concentrations of reducing sugars and amino acids before and after autolysis of L.plantarum SL32-2

圖6 添加自溶酶對L.plantarum SL32-2自溶度的影響Fig.6 Effect of adding autolysin on the autolysin rate of L.plantarum SL32-2

由于乳酸菌自溶酶組分較多,所作用的底物各不相同,將L.plantarumSL32-2自溶酶分別作用于對硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷、對硝基乙酰苯胺、馬脲酰-L-苯丙氨酸和牛血紅蛋白4種底物,檢測β-N-乙酰-葡萄糖胺酶、乙酰胞壁酰胺酶、羧肽酶以及內(nèi)肽酶的活性,結(jié)果如圖7所示。β-N-乙酰-葡萄糖胺酶、乙酰胞壁酰胺酶、羧肽酶、內(nèi)肽酶的活性分別為0.003 6、0.002 7、1.126 7、2.098 7 U。表明作用于肽鏈的內(nèi)肽酶和羧肽酶活性遠高于作用于糖鏈的β-N-乙酰-葡萄糖胺酶及連接糖鏈和肽的酰胺酶,由此可知,內(nèi)肽酶及羧肽酶是L.plantarumSL32-2最主要的PGH。

圖7 L.plantarum SL32-2自溶酶底物特異性分析Fig.7 Analysis of substrate specificity of autolysin from L.plantarum SL32-2

3 結(jié)論

細菌生長過程中合成的自溶酶除了用于細胞生長分裂和程序性死亡外,還可在饑餓誘導條件下篩選高自溶度菌株用于干酪生產(chǎn)[26],也可以提取自溶酶用于控制乳酸菌的生長繁殖。本試驗主要研究了酒醅來源L.plantarumSL32-2自溶酶特性及底物特異性,結(jié)果表明,L.plantarumSL32-2在對數(shù)期早期自溶度最高,其自溶酶最適pH為7.5,最適溫度為37 ℃;將自溶酶添加到該細菌細胞緩沖液中,自溶度增加了12.04%、緩沖液中還原糖增加了1.05倍、氨基酸增加了42.83倍;進一步分析自溶酶的底物特異性發(fā)現(xiàn),L.plantarumSL32-2自溶酶中β-N-乙酰葡萄糖胺酶、酰胺酶、羧肽酶、內(nèi)肽酶的活性分別為0.003 6、0.002 7、1.126 7、2.098 7 U,說明L.plantarumSL32-2作用于肽鏈的酶活性遠高于作用于糖鏈的酶,并且其自溶酶在細胞內(nèi)外均能促進乳酸菌裂解,因此有望通過添加自溶酶的方式,控制乳酸菌的過量生長。