李全，張健，王琪，周妍妍*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)即老年性癡呆，是一種以認(rèn)知功能障礙進(jìn)行性加重為臨床表現(xiàn)的退行性神經(jīng)病[1-2]，其病理改變主要以β-淀粉樣蛋白(amyloid-β, Aβ)沉積、Tau蛋白過度磷酸化所導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle，NFT)為特征[3]。中醫(yī)認(rèn)為腎精虧虛、痰蒙腦竅是AD的基本病機(jī)，地黃飲子出自《黃帝素問·宣明論方》，有補(bǔ)腎、化痰、開竅之功用，現(xiàn)代臨床、實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)地黃飲子防治神經(jīng)退行性疾病有著顯著的療效[4]。課題組前期實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)地黃飲子APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠具有提高學(xué)習(xí)記憶能力、抑制氧化應(yīng)激[5]及神經(jīng)炎癥等作用[6]，為進(jìn)一步探討地黃飲子對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠工作記憶及海馬超微結(jié)構(gòu)的影響，故而進(jìn)行了本次實(shí)驗(yàn)研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取6月齡的雄性APP swe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠60只，體質(zhì)量(25±4)g，同月齡同背景的陰性小鼠30只，體質(zhì)量(23±5)g，購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(江蘇)，編號(hào)：SCXK(蘇)2016-0010，于室溫(22±3)℃、相對濕度(45±5)%的SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室中適應(yīng)性飼養(yǎng)，自由飲食、自由飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

地黃飲子藥物組成：熟地黃、山茱萸、肉蓯蓉、石斛、麥冬、五味子、石菖蒲、遠(yuǎn)志、茯苓、肉桂、炮附子和巴戟天各20 g，生姜、大棗、薄荷各5 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供，將上述飲片浸泡1 h、煎煮1 h后濾出藥液,再次加水煎煮1 h，將2次藥液混合分裝, 4 ℃冷藏備用。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備

多聚甲醛、戊二醛(北京雷根)；鹽酸戊巴比妥鈉(上海斯信)；甲苯胺藍(lán)(美國SIGMA)。Y迷宮、Su-P erMaze行為學(xué)測試軟件(上海欣軟)；透射電鏡(日本HITACHI)；倒置光學(xué)顯微鏡(日本NIKON)；超薄切片機(jī)(德國LEICA)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥

2.2 Y迷宮實(shí)驗(yàn)

Y迷宮行為學(xué)測試于實(shí)驗(yàn)第1、2、3個(gè)月地黃飲子或蒸餾水灌胃結(jié)束后進(jìn)行。正式實(shí)驗(yàn)開始前進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，將小鼠放入迷宮中央?yún)^(qū)任其自由活動(dòng)8 min，每只小鼠活動(dòng)結(jié)束后用75%消毒酒精噴撒宮臂以消除小鼠氣味，適應(yīng)周期為1 d。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，將小鼠頭部朝向起始臂末端擋板，將其放入起始臂自由探索8 min，同時(shí)記錄進(jìn)臂總次數(shù)；計(jì)算小鼠正確自發(fā)交替率，小鼠身體完全進(jìn)入宮臂記為有效進(jìn)臂次數(shù)，每3次進(jìn)入不同的宮臂則記為一次正確的自發(fā)交替，自發(fā)交替率=[正確進(jìn)臂次數(shù)/(總進(jìn)臂次數(shù)-2)]×100%，試驗(yàn)周期為1 d[7]。

2.3 透射電鏡檢測

透射電鏡檢測于行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行，從各實(shí)驗(yàn)月份的空白組、模型組、地黃組隨機(jī)選取3只小鼠，以1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，以4%多聚甲醛(pH=7.4)、生理鹽水心臟灌流至肝臟變?yōu)榘咨瑪囝^取腦并依照腦立體定位圖譜剝離海馬后放入2.5%戊二醛中下固定2 h，將海馬組織樣本修飾成1 mm3小塊，丙酮梯度脫水、包埋、半薄切片處理后甲苯胺藍(lán)染色，倒置光鏡定位后制作超薄切片,經(jīng)醋酸雙氧鈾、枸椽酸鉛雙染色[8]，透射電鏡1 200～4 000倍觀察小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并抓拍照片。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件將所得數(shù)據(jù)處理分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，對實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 地黃飲子對APP/PS1小鼠自發(fā)交替率的影響

3.1.1 實(shí)驗(yàn)第1個(gè)月地黃飲子對APP/PS1小鼠自發(fā)交替率的影響

實(shí)驗(yàn)第1個(gè)月的各組小鼠進(jìn)臂總次數(shù)無差異，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與B1組相比，M1組小鼠正確自發(fā)交替率顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與M1組相比，D1組小鼠正確自發(fā)交替率顯著提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 給藥1個(gè)月Y迷宮測試結(jié)果比較

3.1.2 實(shí)驗(yàn)第2個(gè)月地黃飲子對APP/PS1小鼠自發(fā)交替率的影響

實(shí)驗(yàn)第2個(gè)月的各組小鼠進(jìn)臂總次數(shù)無明顯差異，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與B2組相比，M2組小鼠正確自發(fā)交替率顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與M2組相比，D2組小鼠正確自發(fā)交替率顯著提高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 給藥2個(gè)月Y迷宮測試結(jié)果比較

3.1.3 實(shí)驗(yàn)第3個(gè)月地黃飲子對APP/PS1小鼠自發(fā)交替率的影響

應(yīng)做到真正合理有效的利用現(xiàn)有的資源，結(jié)合水利信息工程建設(shè)自身的特點(diǎn)，有針對性地制訂與其相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，逐步實(shí)現(xiàn)水利信息化建設(shè)的標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)第3個(gè)月的各組小鼠進(jìn)臂總次數(shù)無明顯差異，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與B3組相比，M3組小鼠正確自發(fā)交替率顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與M3組相比，D3組小鼠正確自發(fā)交替率顯著提高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

此外，M3組與M1組小鼠相比正確自發(fā)交替率顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，M3組與M2組小鼠相比正確自發(fā)交替率顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而各給藥月份地黃組小鼠正確自發(fā)交替率無明顯差異，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 給藥3個(gè)月Y迷宮測試結(jié)果比較

3.2 地黃飲子對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠不同時(shí)期病理特征的影響

3.2.1 實(shí)驗(yàn)1個(gè)月地黃飲子對APP/PS1小鼠病理特征的影響

鏡下觀察B1組小鼠海馬CA1區(qū)可見神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目較多、結(jié)構(gòu)完整、分布密集，見圖1A。與B1組相比，M1組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對完整，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少且伴有不同程度的擴(kuò)張，線粒體腫脹，線粒體嵴呈畸形樣改變，鏡下觀察細(xì)胞電子密度不均，散見少量的溶酶體與脂褐素，見圖1B。與M1組相比，D1組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，線粒體輕度腫脹，結(jié)構(gòu)相對完整，形態(tài)較為規(guī)則，見圖1C。

3.2.2 實(shí)驗(yàn)2個(gè)月地黃飲子對APP/PS1小鼠病理特征的影響

至實(shí)驗(yàn)第2個(gè)月，B2組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，見圖1D。M2組與B2組相比小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞染色質(zhì)邊集，可見細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，見圖1E。而地黃飲子組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較多且分布密集，結(jié)構(gòu)完整，可見少數(shù)脂褐素，見圖1F。

3.2.3 實(shí)驗(yàn)3個(gè)月地黃飲子對APP/PS1小鼠病理特征的影響

至實(shí)驗(yàn)第3個(gè)月，B3組小鼠海馬CA1區(qū)少數(shù)線粒體輕度腫脹，鏡下可見散在少量溶酶體，見圖1G。與B3組相比，M3組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞破裂、分散，細(xì)胞固化萎縮后可見凋亡小體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少且伴有不同程度的擴(kuò)張，線粒體腫脹、破裂，溶酶體與脂褐素并見，見圖1H。而D3組小鼠CA1區(qū)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)規(guī)則，與空白組神經(jīng)元細(xì)胞鏡下形態(tài)已較為接近，見圖1I。

圖1 各實(shí)驗(yàn)月份各組小鼠海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)

4 討論

AD是一種起病隱匿并且呈進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，AD病在中醫(yī)上被歸為“癡呆”“呆癥”范疇，腎精虧虛，痰蒙腦竅是其基本病機(jī)，經(jīng)典名方地黃飲子在方劑學(xué)中被歸為陰陽雙補(bǔ)之劑[9]，具有補(bǔ)腎、化痰、開竅之功效，符合AD的中醫(yī)發(fā)病機(jī)制，無論是古代醫(yī)家還是現(xiàn)代醫(yī)家運(yùn)用地黃飲子防治老年性癡呆都有著顯著療效，故本實(shí)驗(yàn)選用地黃飲子探討其對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠工作記憶及海馬超微結(jié)構(gòu)的影響。

通過對Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)月份的各組小鼠的進(jìn)臂總次數(shù)并無明顯差異(P>0.05)，說明小鼠視力及運(yùn)動(dòng)能力正常，排除體力及視力對小鼠探索迷宮的影響。隨著實(shí)驗(yàn)月份的增加，模型組APP/PS1小鼠自發(fā)交替率逐漸降低，尤其是M3組與M1、M2組相比，APP/PS1小鼠工作記憶能力顯著降低；而經(jīng)地黃飲子干預(yù)的APP/PS1小鼠自發(fā)交替率逐漸上升，這表明地黃飲子能夠提高APP/PS1小鼠的工作記憶能力，并且隨著給藥時(shí)間的增加呈逐漸上升的趨勢。

本課題組基于前期HE染色、尼氏染色、免疫熒光染色等實(shí)驗(yàn)[10]，探討了光鏡下APP/PS1小鼠海馬區(qū)的病理改變，為進(jìn)一步觀察APP/PS1小鼠海馬區(qū)的超微結(jié)構(gòu)改變，本實(shí)驗(yàn)采用了透射電鏡呈像技術(shù)。經(jīng)透射電鏡鏡下觀察顯示，隨著實(shí)驗(yàn)月份的增加，模型組小鼠海馬CA1區(qū)線粒體逐漸發(fā)生腫脹、變形、破裂，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，并隨著小鼠月齡的增加凋亡小體逐漸增多；而經(jīng)地黃飲子干預(yù)的APP/PS1小鼠海馬CA1區(qū)線粒體只是輕度腫脹，同時(shí)神經(jīng)細(xì)胞也未發(fā)生凋亡現(xiàn)象，并且隨著給藥時(shí)間的增加神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)已與空白組相接近。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)在B3組小鼠海馬CA1區(qū)線粒體出現(xiàn)了輕度的腫脹、變形的改變，這表明即使是陰性空白組小鼠也會(huì)隨著月齡的增長線粒體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變，而地黃飲子能夠顯著保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，抑制細(xì)胞的凋亡，改善線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)，這與課題組既往研究[11]的地黃飲子含藥腦脊液可減輕細(xì)胞的受損程度，提高細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

綜上，各實(shí)驗(yàn)月份的各組小鼠的病理學(xué)改變與行為學(xué)改變相一致，APP/PS1小鼠隨著月齡增加工作記憶能力呈進(jìn)行性下降，線粒體發(fā)生腫脹變形，并且至小鼠9月齡時(shí)出現(xiàn)大量的凋亡小體；地黃飲子可改善APP/PS1小鼠隨月齡增長而下降的工作記憶能力，并抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)。