左安欣，張曉妹，仇 瑋

(南京市江寧醫(yī)院病理科，江蘇 南京 211100)

肺癌是全世界發(fā)病率和死亡率均為最高的腫瘤[1]，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%～85%[2-4]。肺癌傳統(tǒng)的治療方法總體預(yù)后較差，5年生存率低于20%[5-8]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，某些基因的突變可驅(qū)動(dòng)肺癌的發(fā)生發(fā)展，即肺癌的驅(qū)動(dòng)基因。針對(duì) NSCLC的常見(jiàn)驅(qū)動(dòng)基因(如 EGFR、ALK、ROS1、RET、BRAF、HER-2和MET 等)研究出了相應(yīng)的靶向治療藥物，明顯延長(zhǎng)了肺癌患者中位生存期，并使其療效得到顯著改善[8-9]。這些驅(qū)動(dòng)基因的研究為個(gè)體化治療及靶向治療的推廣奠定了基礎(chǔ)。美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南明確指出，在進(jìn)行靶向治療前需要對(duì)基因的突變狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，并建議對(duì)更廣泛的有效基因進(jìn)行檢測(cè)[10]。因此，多基因聯(lián)合突變檢測(cè)可以為臨床靶向治療提供更有效、更精準(zhǔn)的治療方法。鑒于此，本研究采用探針擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)PCR(ARMS-PCR)法檢測(cè)83例 NSCLC患者驅(qū)動(dòng)基因突變情況，并分析其基因突變與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，為判斷疾病發(fā)展過(guò)程、預(yù)后及靶向治療提供分子病理學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集南京市江寧醫(yī)院病理科2020年1月至2021年7月經(jīng)手術(shù)切除、穿刺、活檢及胸腔積液等NSCLC 樣本83例，其中腺癌76例，鱗癌4例，未分化癌1例，肉瘤樣癌2例，其病理診斷明確為NSCLC，且患者無(wú)血液系統(tǒng)疾病、免疫缺陷疾病及其他惡性腫瘤等嚴(yán)重影響研究結(jié)果的病癥，同時(shí)有足夠的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分子病理檢測(cè)。

1.2主要試劑和儀器 核酸提取試劑盒、10種(ALK、ROS1、RET、EGFR、KRAS、HER-2、PIK3CA、NRAS、MET和BRAF)突變基因檢測(cè)的試劑盒(熒光PCR法)均由廈門(mén)艾德生物公司提供。熒光定量PCR儀為宏石SLAN-48P/96S，杭州奧盛Nano-300紫外分光光度計(jì)。

1.3方法 根據(jù)蘇木素-伊紅(HE)染色，先在顯微鏡下圈出腫瘤區(qū)域，將腫瘤區(qū)域的蠟塊切成蠟卷，每個(gè)腫瘤樣本總共收集2管，分別用于DNA和RNA的提取。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。提取后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA/RNA質(zhì)量及濃度，將濃度稀釋至2～5 ng/μL備用。福爾馬林固定石蠟包埋的組織DNA、RNA提取試劑盒(EGFR、ALK、ROS1、RET、KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF、HER-2九基因聯(lián)合檢測(cè)試劑盒)和MET突變檢測(cè)試劑盒。具體操作步驟嚴(yán)格參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，體系將在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。應(yīng)用Pearson卡方檢驗(yàn)，連續(xù)校正的卡方檢驗(yàn)及Fisher精確概率法分析基因突變與臨床病理特征的相關(guān)性，所有P值均基于雙向假設(shè)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.110種基因突變分布 檢測(cè)的83例標(biāo)本中，10種基因總突變率為74.70%(62/83)。41例出現(xiàn)了EGFR突變(49.40%)，其中19例為19號(hào)外顯子缺失(19-Del)，15例為21號(hào)外顯子基因突變(L858R)，3例為20號(hào)外顯子插入突變(20-Ins)，3例為18號(hào)外顯子G719X突變，1例為21號(hào)外顯子L861Q突變。4例出現(xiàn)ALK基因融合突變(4.82%)，4例出現(xiàn)ROS1基因融合突變(4.82%)，11例出現(xiàn)KRAS基因突變(13.25%)，3例出現(xiàn)HER-2基因突變(3.61%)，2例出現(xiàn)MET 14號(hào)外顯子跳躍突變(2.41%)，另外，PIK3CA基因突變?yōu)?例(1.20%)。見(jiàn)圖1。

圖1 83例NSCLC患者突變率示意圖

2.210種驅(qū)動(dòng)基因突變與臨床病理特征的相關(guān)性 在本組83例NSCLC患者的樣本中，經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，EGFR突變率最高，占比49.40%，女性EGFR突變率高于男性，肺腺癌高于肺鱗癌，且年齡≥60歲者為高發(fā)人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。KRAS突變?cè)谀行曰颊咧械陌l(fā)生率高于女性(P<0.05)，且高發(fā)于年齡≥60歲者。此外，HER-2、NRAS、BRAF、PIK3CA、RET、ROS1突變率較低，由于本組納入研究的病例數(shù)過(guò)少，均尚未發(fā)現(xiàn)其與患者性別、年齡、組織學(xué)類(lèi)型存在明顯相關(guān)性。

表1 NSCLC的10種驅(qū)動(dòng)基因突變者的臨床特征

2.3雙突變樣本的組織病理特征 本組研究中，1例出現(xiàn)了EGFR、KRAS共突變(圖2A)，1例出現(xiàn)了EGFR、PIK3CA 共突變(圖2B)。其中，后者可以采用相應(yīng)的靶向藥物進(jìn)行治療。由于 KRAS屬于EGFR下游，EGFR、KRAS 共突變患者對(duì)EGFR抑制劑療效欠佳。雙突變的產(chǎn)生可能源于腫瘤異質(zhì)性[11]，亦或?yàn)橥荒[瘤細(xì)胞攜帶2種驅(qū)動(dòng)突變[12]。通過(guò)結(jié)合雙突變樣本的 HE 切片和免疫組化染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙突變樣本的組織病理學(xué)都是肺腺癌，并且組織學(xué)形態(tài)相似，未發(fā)現(xiàn)特有的病理特征。因此不能單從組織形態(tài)學(xué)推斷是否有驅(qū)動(dòng)基因的共突變。

A.EGFR、KRAS 共突變；B.EGFR、PIK3CA 共突變。

3 討 論

EGFR是酪氨酸激酶Ⅰ型受體家族的成員之一。EGFR與配體結(jié)合會(huì)導(dǎo)致重要的構(gòu)象變化，轉(zhuǎn)導(dǎo)下游信號(hào)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、存活和一系列復(fù)雜的過(guò)程[13]。EGFR的酪氨酸激酶活性位點(diǎn)主要位于18號(hào)外顯子到24號(hào)外顯子之間，因此，其激活突變和耐藥突變也集中在這個(gè)區(qū)間。以往研究數(shù)據(jù)表明，EGFR基因的突變率在亞洲為30%～51%[14]，SHI等[15]認(rèn)為EGFR突變?cè)诜蜗侔⑴?、亞洲人和從不吸煙的人群中更為常?jiàn)。本研究顯示，EGFR總突變率為49.40%(41/83)，且女性高于男性，肺腺癌高于肺鱗癌，符合以往研究結(jié)果。此外，EGFR是10種基因中突變率最高的，種類(lèi)多樣，最常見(jiàn)的類(lèi)型為19號(hào)外顯子缺失和21號(hào)外顯子L858R突變[16]，本研究符合既往報(bào)道。其中，19號(hào)外顯子突變占總突變的46.34%(19/41)，且以缺失突變?yōu)橹?，點(diǎn)突變及插入突變少見(jiàn)；21號(hào)外顯子突變占總突變的39.02%(16/41)，且以L858R點(diǎn)突變?yōu)橹鳎渌稽c(diǎn)突變少見(jiàn)；18號(hào)外顯子突變占總突變的7.32%(3/41)，均為G719X突變；20號(hào)外顯子突變占總突變的7.32%(3/41)。有研究報(bào)道，18號(hào)、19號(hào)和21號(hào)外顯子易受環(huán)境致癌物的攻擊，突變后可能進(jìn)一步激活EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要的作用[17]。

KRAS是RAS 基因家族的一員。當(dāng)細(xì)胞外的生長(zhǎng)分化因子將信號(hào)傳導(dǎo) KRAS 蛋白時(shí)，啟動(dòng)了細(xì)胞開(kāi)關(guān)，導(dǎo)致信號(hào)系統(tǒng)開(kāi)放，激活不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[18]。有研究表明，KRAS突變?cè)谀行?、老年患者、吸煙者、肺腺癌中較為常見(jiàn)[19]，在亞洲人群中其發(fā)生率為10%～15%[20]。本研究中，KRAS突變發(fā)生率居第2位(13.25%，11/83)，在男性患者中，發(fā)生率高于女性，且高發(fā)于年齡≥60歲者，與既往研究KRAS 基因突變結(jié)果相符。

NSCLC中ALK融合基因最常見(jiàn)的類(lèi)型為EML4-ALK融合基因[21]，它們產(chǎn)生的融合蛋白能夠使ALK受體持續(xù)自磷酸化，激活下游信號(hào)通路,導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[21]。研究報(bào)道，ALK重排常見(jiàn)于男性、年輕的晚期肺腺癌患者[22]，ALK 融合發(fā)生率為2%～7%[23]，本文ALK基因融合突變率(4.82%，4/83)與報(bào)道相符。此外，研究表明約有2%的 NSCLC 病例發(fā)生ROS1基因重排[24]，本研究結(jié)果稍高(4.82%，4/83)，由于本組研究樣本例數(shù)過(guò)少，對(duì)這類(lèi)突變患者的有效性還需加大樣本量繼續(xù)進(jìn)行研究。

本研究采用ARMS-PCR檢測(cè)方法，具有操作簡(jiǎn)便，易掌握等諸多優(yōu)點(diǎn)。此外，ARMS-PCR法具有高靈敏性，只對(duì)指定基因進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)標(biāo)本的DNA濃度及質(zhì)量要求較低，能檢測(cè)出樣本中低至1%的突變[25]。隨著更多驅(qū)動(dòng)突變基因被發(fā)現(xiàn),以及相關(guān)藥物的研發(fā)，單基因檢測(cè)在時(shí)效性、樣本消耗量等方面將出現(xiàn)更多的局限性。因此，多基因聯(lián)合檢測(cè)能夠同時(shí)檢測(cè)多種熱點(diǎn)突變，提高檢測(cè)效率，節(jié)省樣本，從而為患者的靶向治療提供更有效、更精準(zhǔn)的治療方法。但本研究尚存在一定的局限性，納入的病例數(shù)相對(duì)較少，樣本數(shù)量的不足一定程度影響了分析結(jié)果的穩(wěn)定性，有待檢測(cè)更大樣本的人群數(shù)據(jù)，以進(jìn)一步探究多基因突變檢測(cè)的臨床應(yīng)用價(jià)值。

總之，NSCLC患者中EGFR基因存在較高的突變率，尤其為19號(hào)和21號(hào)外顯子突變，其基因突變分型能指導(dǎo)表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)的腫瘤靶向治療，KRAS基因突變率雖低,但也不容忽視，其基因突變預(yù)示著EGFR-TKI原發(fā)耐藥。本研究所得結(jié)果對(duì)臨床指導(dǎo)肺癌靶向用藥有一定的積極作用。