夏 鑄，蔣煒濱，夏 彪

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學科，重慶 400016)

近年來，越來越多的研究都表明許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病都與炎癥相關。小膠質(zhì)細胞(MG)作為一種CNS內(nèi)固有的免疫細胞，可以通過其遷移、增殖及分泌的細胞因子來避免腦細胞在急性腦部炎癥病變中受到進一步損傷。但在慢性CNS炎癥性病變中，MG會誘導一些自身免疫反應，對機體產(chǎn)生不良后果。在許多炎性病程中都發(fā)現(xiàn)有MG的激活[1]，例如腦梗死、多發(fā)性硬化(MS)、阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)等。

正電子發(fā)射斷層掃描(PET)是一種無創(chuàng)成像技術，能夠可視化和量化藥物在體內(nèi)的生化和藥理學過程。一種轉位蛋白(TSPO)的特異性PET顯像劑可以在活體中評估大腦中神經(jīng)炎癥(激活的MG)的狀態(tài)。11C-PK11195是第1個廣泛用于評估的TSPO 的PET顯像劑，但其低信噪比和高的非特異性結合阻礙了其進一步應用。一些新的TSPO特異性配體，如11C-DAA1106、18F-FEDAA1106和11C -PBR28等在嚙齒類動物大腦中顯示出良好的體內(nèi)特性[2]。DPA-714是具有高親和力的吡唑并嘧啶類的TSPO配體，目前已應用到動物和人類的PET顯像研究中。18F-DPA-714(logP為2.44)與11C-PK11195(logP為3.35)相比，具有更好的生物利用度和更低的非特異性結合。在健康人體的研究中，18F-DPA-714在體內(nèi)的代謝穩(wěn)定性和生物分布較好，并且有效劑量(17.2 μSv/MBq)適中，表明其可能是一個對神經(jīng)炎性病變敏感、具有臨床應用前景的PET顯像劑[3-4]。本研究旨在探索一種簡單、高效、自動化合成18F-DPA-714的方法，并對其進行質(zhì)量控制，以期為臨床使用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 HM-10型回旋加速器和 CFN-F100多功能合成模塊(日本住友重工業(yè)株式會社)，高效液相色譜(HPLC)儀(美國Alltech公司)，201型HPLC紫外檢測器(美國 LabAlliance公司)，HPLC放射性檢測器(B-FC-3200，美國BIOSCAN公司)，H218O豐度98%(上?；ぱ芯吭?，無菌濾膜Millex(美國Millipore公司)，冷化合物19F-DPA-714標準品及藥物合成前體(北京派特生物，純度>99%)，色譜純乙腈、乙醇(美國Sigma公司)，醋酸銨(分析純，成都科龍)，Kryptofi2.2.2(K2.2.2)(德國ABX公司)，QMA柱、C18小柱(美國Waters公司)，CRC.25R活度計(美國Capintec公司)，電子天平(上海舜宇恒平)，半制備型色譜柱(YMS，AM12305-2510 WT，ODS-AM，250 mm×10 mm，S-5 μm)，分析型色譜柱(Alltima C18，250 mm×4.6 mm 5 u，美國Grace公司)，清潔級ICR小鼠由重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供。

1.218F-DPA-714的自動化合成 參考Michelle L.James的合成方法[5-6]，合成路線見圖1，采用住友CFN-F100多功能合成模塊，經(jīng)自主編輯自動化程序(圖2)。使用醫(yī)用回旋加速器60 μA束流，打靶30 min，通過核反應18O(p，n)18F生產(chǎn)18F-，18F-傳入到多功能合成模塊中，18F-經(jīng)QMA柱捕獲18F-，用相轉移催化劑 K2.2.2/K2CO3溶液0.9 mL，將18F-從QMA柱上洗脫至反應瓶中，通氮氣條件下，110 ℃干燥5 min，除去水分，再次加入1 mL無水乙腈，氮氣條件下，90 ℃干燥3 min，使18F-與K2.2.2混合物完全除去水分。將1 mL乙腈前體溶液(2～4 mg/mL)加入至反應瓶，95 ℃密閉加熱反應10 min，得粗產(chǎn)品冷卻后，轉移至半制備型HPLC C18反相柱(250 mm×10 mm，5 μm)，再次加入1.5 mL乙腈至反應瓶中，將反應瓶壁殘留物再次轉移至半制備型HPLC C18反相柱，進行分離純化，制備型色譜分離條件為：流動相為V(乙腈)∶V(0.1 mol/L NH4OAc)=60∶40，流速4 mL/min，收集6.5 min左右的放射性產(chǎn)品峰于中間瓶，加30 mL水稀釋產(chǎn)品中的乙腈濃度，再轉移至C18小柱富集產(chǎn)品，用10 mL水沖洗C18小柱，進一步除去乙腈，最后用1 mL乙醇洗脫產(chǎn)品，并過有機相無菌濾膜，加入生理鹽水稀釋乙醇濃度至10%以下制成可用于靜脈注射的產(chǎn)品。從18F-傳入合成模塊至獲得最終產(chǎn)品，整個過程為自動化合成，無須人工添加物料，極大地避免了藥物的輻射。

圖1 18F-DPA-714的合成路線

圖2 18F-DPA-714自動化控制程序流程圖

1.3質(zhì)量控制 物理檢查：觀察產(chǎn)品透明度和顏色，測定放射活度?；瘜W檢查：測 pH值、產(chǎn)品穩(wěn)定性和放射化學純度。采用HPLC，色譜條件為色譜柱：Alltima C18，250 mm×4.6 mm 5 u，流動相為V(乙腈)∶V(0.1 mol/L NH4OAc)=60∶40，流速1 mL/min，波長254 nm，柱溫25 ℃，放射性檢測器為BIOSCAN，B-FC-3200。分別進樣冷化合物19F-DPA-714標準品、藥物合成前體及產(chǎn)品各10 μL，記錄保留時間。產(chǎn)品在0、2、4 h時分別進樣測定放射化學純度，以觀察放射化學純度有無變化。

1.4比活度測定 取冷化合物19F-DPA-714標準品1.06 mg，配制成1.06 mg/mL乙腈溶液，用乙腈稀釋成以下系列濃度，分別為0.331 25、0.662 5、1.325、2.65、5.3、10.6、21.2 μg/mL，色譜條件同上，進樣10 μL，繪制19F-DPA-714濃度與峰面積標準曲線。18F-DPA-714產(chǎn)品進樣10 μL，記錄產(chǎn)品紫外峰面積和放射性濃度，根據(jù)標準曲線計算18F-DPA-714比活度。

1.5細菌內(nèi)毒素檢測 待18F-DPA-714完全衰變至無活度后，取樣委托重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科對該藥物溶液進行內(nèi)毒素檢查及無菌檢查。

1.6異常毒性試驗 取小鼠5只，每只尾靜脈注射18F-DPA-714約11 MBq，觀察48 h，記錄小鼠的活動狀態(tài)及體重變化。

2 結 果

2.118F-DPA-714的自動化合成結果 利用CFN-F 100多功能合成模塊經(jīng)自主編輯自動化程序后，進行18F-DPA-714全自動合成，整個合成過程無須人為干預，避免了操作人員的輻射危險。本實驗采用親和取代標記法，前體投入為2～4 mg，整個制備耗時約為55 min，經(jīng)半制備型HPLC純化后，放射化學純度>99%，未衰減校正的合成效率為18%～36%(n=20)，為18F-DPA-714的研究和臨床應用提供了保障。

2.2質(zhì)量檢測結果 本品為無色透明溶液，pH值為6左右，放射化學純度>99%，18F-DPA-714在上述分析色譜條件下，保留時間為8.8 min左右，與標準品19F-DPA-714保留時間(8.2 min左右)基本一致(紫外檢查器在放射性監(jiān)測器前端，故放射峰會稍有延遲)(圖3、4)，且與前體保留時間(約11.0 min)有明顯差異(圖5)。穩(wěn)定性測試結果顯示，0、2、4 h放射化學純度均保持在98%以上，無明顯變化。

圖3 19F-DPA-714的紫外圖譜

圖4 18F-DPA-714的放射圖譜

圖5 DPA-714前體的紫外圖譜

2.3比活度 采用不同濃度標準品19F-DPA-714繪制標準曲線，其公式為y=22 981x+2 048，R2=0.999 8，線性良好，經(jīng)計算結果顯示，18F-DPA-714比活度可達675 GBq/mg。比活度足夠高，可以滿足臨床使用。

2.4細菌內(nèi)毒素檢測 經(jīng)重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科按照《中國藥典2020年版》中方法檢測，內(nèi)毒素、無菌檢查均為陰性，符合注射液使用標準。

2.5毒性試驗 小鼠注射18F-DPA-714后，48 h內(nèi)每只小鼠均正常生長，無異常反應及死亡現(xiàn)象發(fā)生。

3 討 論

炎癥顯像是核醫(yī)學領域熱點話題，18F-FDG仍然是應用最為廣泛的，但其為廣譜的正電子顯像劑，針對炎癥的顯像恰恰存在不足。MG在AD發(fā)病機制中的作用已經(jīng)受到廣泛關注，MG激活而高表達的TSPO靶點也成為神經(jīng)炎性疾病顯像的研究熱點[7-8]。11C-PK11195作為廣泛應用的神經(jīng)炎性病變顯像劑，雖已用于動物和臨床研究，但其半衰期短(20.3 min)和藥代動力學方面的不足限制了其進一步的臨床應用。

TSPO是一種相對分子量為18×103，位于線粒體膜外的具有5個跨膜結構域的蛋白，主要表達于合成類固醇的內(nèi)分泌器官，包括心臟、腎臟、腎上腺皮質(zhì)、睪丸或卵子[9]。在巨嚼細胞、中性粒細胞、淋巴細胞，以及激活的MG等，都是呈現(xiàn)高表達水平[10-11]。TSPO最典型的功能之一是參與膽固醇從線粒體外膜向線粒體內(nèi)膜的轉運，這對類固醇的合成至關重要[12]。在CNS中，TSPO在神經(jīng)炎癥狀態(tài)下顯著上調(diào)，TSPO的異常過度表達是許多其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病進展中的關鍵病理信號。研究發(fā)現(xiàn)，MG在AD的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，MG在致炎因子作用下被激活成反應性MG，產(chǎn)生大量前體炎性因子，從而導致神經(jīng)變性的發(fā)生[13]。正常情況下TSPO在CNS中低表達，并且局限在神經(jīng)膠質(zhì)細胞(星形膠質(zhì)細胞和MG)中，在發(fā)生腦損傷或炎性病變時，TSPO 表達上調(diào)。而神經(jīng)炎癥發(fā)生在AD發(fā)作前階段，是主要的驅動力。TSPO也與AD和缺血引起的梗死密切相關[14-15]。動物研究方面，有研究證實了TSPO特異性示蹤劑可以觀察到大鼠腦缺血模型中腦梗區(qū)域的放射性攝取[16]；在AD中，示蹤劑在腦內(nèi)的濃聚也發(fā)現(xiàn)與AD特異性Tau蛋白聚集部位密切相關。此外，轉運蛋白顯像還在動脈粥樣硬化性疾病中得到了應用[11]。所以，用PET顯像位于MG上的TSPO，已經(jīng)成為研究CNS炎癥的重要手段，TSPO也成為PET顯像的重要靶點，可用于檢測與腦部疾病相關的炎癥，并監(jiān)測抗炎療法的治療反應。

本研究采用日本住友CFN-F100多功能合成模塊，可以很好地根據(jù)需要實現(xiàn)的合成反應進行自主編輯自動化合成程序，實現(xiàn)自動化合成，能很好地避免放射性藥物的輻射，這對放射性藥物的制備至關重要。本研究中18F-DPA-714的合成制備主要通過親核取代反應進行氟化。該反應成敗的關鍵在于18F-的干燥除水，本實驗中采用2次加入乙腈，通氮氣條件下，干燥除水，保證18F-在K2.2.2的作用下與前體進行氟化。結合文獻中已經(jīng)有的相應氟化反應溫度和氟化反應時長[5]?？紤]放射性藥物前體價格昂貴的因素，本研究主要考察了前體的用量，分別考察了1、2、4 mg前體用量下的產(chǎn)品收率，結果顯示，1 mg前體時，收率不足10%，2 mg和4 mg前體產(chǎn)品收率(22%vs.24%)相差不大，考慮藥物制備成本，故本實驗確定采用2 mg前體用量為宜。此外，本實驗中，前體氟化反應結束冷卻后，無須在進入半制備型HPLC前進行去除18F-的預處理，直接將反應液加入半制備型HPLC進樣器中，增加1次1.5 mL乙腈清洗反應器(將殘留在反應器壁上的混合物洗出)，連同反應液一起加入到半制備型HPLC中進行純化分離。經(jīng)標準品19F-DPA-714進樣預實驗確定，該藥物的出峰時間為6.5 min，在合成純化處理中，18F-DPA-714的出峰時間與標準品相同，收集6.5 min左右的產(chǎn)品峰，加30 mL水稀釋乙腈濃度至10%以下(減少產(chǎn)品在C18小柱中的漏傳損失)，采用C18小柱進行18F-DPA-714產(chǎn)品富集，進一步用13 mL水沖洗C18小柱，以便除去產(chǎn)品中的乙腈，最后采用1.5 mL乙醇洗脫產(chǎn)品，過無菌濾膜后，加生理鹽水至乙醇濃度達10%以下即得最終產(chǎn)品。

經(jīng)過考察，本研究確定的色譜分析條件為色譜柱：Alltima C18，250 mm×4.6 mm 5 u，流動相為V(乙腈):V(0.1 mol/L NH4OAc)=60∶40，流速1 mL/min，波長254 nm，柱溫25 ℃，放射性檢測器為BIOSCAN，B-FC-3200。該條件下，標準品19F-DPA-714(紫外圖譜保留時間為8.2 min)和18F-DPA-714(放射圖譜保留時間為8.8 min)與前體(紫外圖譜保留時間為11.0 min)之間能很好地分開，說明該體系下系統(tǒng)適用性好。經(jīng)分析型HPLC分析，該產(chǎn)品18F-DPA-714放射化學純度>99%，比活度高達675 GBq/mg，穩(wěn)定性好，適用于動物實驗及臨床研究。該藥物logP為2.44，在親和力、信噪比、生物分布和代謝穩(wěn)定性方面都優(yōu)于11C-PK11195[3-4]，能很好地穿過血腦屏障，迅速分布到腦組織中，可應用于腦部的神經(jīng)炎性疾病等方面的研究。

本實驗中建立的在線自動化合成方法，成功制備出TSPO特異性顯像劑18F-DPA-714，收率穩(wěn)定，產(chǎn)量高，建立的質(zhì)量控制方法能很好地測定其放射化學純度和比活度，該方法制備的18F-DPA-714各項指標均符合標準。本研究為后續(xù)開展的動物研究和臨床應用研究奠定了堅實的基礎。