馬琳琳，趙學(xué)科，宋 昕，徐瑞華，魏夢(mèng)霞，李留玉,，尤 朵,3，王 苒，韓雪娜，孫 琳,，陳亞杰,，喬佳欣，謝葉真，白合林，王立東

食管癌是全球最常見的六大惡性腫瘤之一，有極高的發(fā)病率和死亡率[1-2]。每年全球新發(fā)食管癌患者約50萬例，其中發(fā)生在中國的占2/3[3-4]。中國食管癌突出的流行病學(xué)特點(diǎn)是顯著的地域性分布和明顯的家族聚集性，從而形成明顯的食管癌高低發(fā)區(qū)[5]。河南、山西和河北交界的太行山地區(qū)，是中國，也是全球食管癌發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)，特別是河南林州[6-8]。中國97%以上的食管癌為食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)[9]，食管癌的發(fā)生、發(fā)展是遺傳和環(huán)境因素交互作用的結(jié)果[10]。以往絕大多數(shù)報(bào)道關(guān)于食管癌的發(fā)生是由各種外在因素引起的，而內(nèi)在因素，比如基因突變?cè)谀[瘤發(fā)展的過程中同樣起到非常重要的作用。此外，從遺傳流行病學(xué)得出，涉及癌變過程中不同的基因多態(tài)性也可能會(huì)使個(gè)體對(duì)食管癌的易感性發(fā)生改變，這種多態(tài)性也對(duì)癌癥的預(yù)防和治療起到了非常關(guān)鍵的作用[11]。

β-半乳糖苷酶(Beta-galactosidase，GAL)是一種溶酶體外糖苷酶，通過釋放β連接的末端半乳糖殘基參與糖共軛物的分解代謝。當(dāng)酒精和尼古丁依賴性與結(jié)腸癌重合，高活性的β-半乳糖苷酶可能加速了癌癥的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和成熟[12]。β-半乳糖苷酶在GH分泌和NFPA中有明顯的高表達(dá)，在癌組織中也有顯著的高表達(dá)。作者推測(cè)，這可能是腫瘤惡性進(jìn)展罕見的原因[13]。同時(shí)也有大量研究表明β-半乳糖苷酶1(GLB1)參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和細(xì)胞衰老[14]。因此，本課題研究SEZ6L2 rs7533174單核苷酸多態(tài)性和GLB1之間的關(guān)聯(lián)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象的采集

納入的199例患者均來自于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院省部共建食管癌防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中的50萬例食管癌患者臨床信息數(shù)據(jù)庫[15-16]。患者均來自于河南省食管癌高發(fā)區(qū)的某市級(jí)醫(yī)院，經(jīng)醫(yī)院確診并進(jìn)行手術(shù)治療，確診時(shí)間為2019年11月至2020年1月。其中男132例(66.33%)，女67例(33.67%)，每位患者均簽了知情同意書，并經(jīng)鄭州大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。收集199例ESCC患者的癌組織和癌旁組織，均為手術(shù)切除后30 min內(nèi)的新鮮組織樣本，并進(jìn)行宏觀解剖，然后保存在-80 ℃冰箱。樣本采集前沒有接受放化療等抗肺瘤治療，然后以半定量的方式對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行視覺評(píng)分，僅選擇其中惡性細(xì)胞>70%的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行全基因組外顯子測(cè)序。癌旁正常組織是從距腫瘤邊緣至少2 cm遠(yuǎn)的鄰近上皮正常組織(對(duì)照)，用于取樣和分子分析。

本研究主要通過電話、到家隨訪、鄉(xiāng)村醫(yī)生與患者或患者家屬直接聯(lián)系，以及新合作醫(yī)療數(shù)據(jù)庫、醫(yī)療保障局?jǐn)?shù)據(jù)庫和公民死亡信息登記管理等系統(tǒng)查詢方式進(jìn)行隨訪，每半年進(jìn)行一次隨訪，記錄健在或去世以及去世時(shí)間和主要死因等。

1.2 組織樣本的制備

將199例ESCC患者的癌組織和癌旁組織配對(duì)，分裝到提前準(zhǔn)備好的已經(jīng)標(biāo)記的凍存管內(nèi)，樣本編號(hào)為001～199號(hào)，ESCC組織用字母T標(biāo)記(Tumor)，癌旁正常組織用字母N標(biāo)記(Normal)。收集到的樣品在液氮中快速冷凍并保存，同時(shí)要保證每份樣品有足夠的DNA可供提取，然后用CTAB法提取DNA。

1.3 多組學(xué)SNP位點(diǎn)捕獲、檢測(cè)與篩選

1.3.1 DNA樣品檢測(cè)利用瓊脂糖凝膠電泳來分析DNA樣本是否含有蛋白、RNA污染及其降解程度。如果DNA出現(xiàn)降解，對(duì)應(yīng)的條帶就會(huì)變暗或者消失。并用Qubit 3.0測(cè)出DNA樣本濃度，選擇0.6 μg以上的樣品進(jìn)行后續(xù)建庫。

1.3.2 建庫捕獲及上機(jī)測(cè)序采用Agilent液相芯片捕獲系統(tǒng)對(duì)人全外顯子區(qū)的DNA進(jìn)行富集，Agilent SureSelect Human All Exon V6試劑盒進(jìn)行建庫及捕獲，后在Illumina平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.3 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制高通量測(cè)序獲得的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)過轉(zhuǎn)化后形成原始Raw Data測(cè)序序列。將原始Raw Data數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，并且控制平均堿基位置測(cè)序錯(cuò)誤率低于0.1%，樣本的測(cè)序reads達(dá)到95%以上的對(duì)比率，且堿基覆蓋深度達(dá)到10×以上時(shí)，該點(diǎn)檢測(cè)的SNP相對(duì)比較可信。

1.3.4 多組學(xué)SNP位點(diǎn)篩選實(shí)驗(yàn)方法為全基因組外顯子測(cè)序WES(whole exome sequencing)(WES測(cè)序由諾禾致源測(cè)序公司進(jìn)行)，基于WES數(shù)據(jù)中所檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)，經(jīng)過將正常與癌組織中都有的SNP進(jìn)行比對(duì)，共有62萬個(gè)SNP；其中以編碼區(qū)非同義突變、P<0.2為條件篩選出的SNP位點(diǎn)有3 897個(gè)；在GT和Mutation表中都存在且生存曲線有差異的有797個(gè)位點(diǎn)。rs75331747 SNP在患者的癌組織和癌旁組織中是一致的。

1.4 蛋白表達(dá)的測(cè)定

采用液相色譜—質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)技術(shù)對(duì)199例ESCC患者的癌組織和癌旁組織樣本進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 SEZ6L2基因SNP rs75331747與ESCC生存與預(yù)后的關(guān)聯(lián)性分析

199例ESCC患者中，有136例G/G基因型個(gè)體，51例G/T基因型個(gè)體，12例T/T基因型個(gè)體；T/T基因型個(gè)體的生存率顯著高于G/G基因型個(gè)體，T/T基因型個(gè)體的生存率高于G/T基因型個(gè)體，G/T基因型個(gè)體的生存率高于G/G基因型個(gè)體(P<0.001)。見圖1。

圖1 3種基因型術(shù)后生存分析比較

2.2 SEZ6L2 rs75331747基因型與GLB1蛋白表達(dá)之間的關(guān)系

eQTL分析發(fā)現(xiàn)，eQTL距離調(diào)控基因非常遠(yuǎn)，大于20 Mb以上，可能通過調(diào)控SEZ6L2基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白來介導(dǎo)靶基因的表達(dá)。作者做了rs75331747與GLB1蛋白表達(dá)量關(guān)系的研究。相對(duì)于rs75331747的參考型GG，突變型TT型蛋白表達(dá)量最少，rs75331747突變后，通過調(diào)控SEZ6L2基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄子，顯著降低GLB1的表達(dá)。見圖2。

圖2 rs75331747的3種基因型GLB1蛋白表達(dá)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，食管癌的發(fā)生和發(fā)展是基因—遺傳—環(huán)境交互作用共同導(dǎo)致的結(jié)果[10]。本研究探討SEZ6L2基因rs75331747(G>T)多態(tài)性與ESCC患者生存之間的關(guān)系。在單個(gè)核苷酸位點(diǎn)分析時(shí)，SEZ6L2基因rs75331747 SNP位點(diǎn)與ESCC患者生存有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的關(guān)聯(lián)。提示SEZ6L2基因SNP與ESCC患者生存結(jié)局有關(guān)系，可能成為預(yù)測(cè)ESCC患者生存的潛在預(yù)后標(biāo)志物。

通過檢查rs75331747遺傳變異對(duì)GLB1表達(dá)的潛在調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)rs75331747 G等位基因是風(fēng)險(xiǎn)等位基因。在199例人食管組織標(biāo)本的基因型—蛋白相關(guān)分析中，rs75331747 G/T或G/G與GLB1蛋白表達(dá)顯著增加相關(guān)(P<0.001)。本研究數(shù)據(jù)表明，SEZ6L2 rs75331747 SNP與ESCC的易感性相關(guān)，GLB1可能參與ESCC發(fā)生。

SEZ6L1基因SNP rs75331747影響GLB1蛋白的表達(dá)，GLB1蛋白的表達(dá)與ESCC患者的生存預(yù)后相關(guān)。正常人SEZ6L1基因rs75331747的第713位堿基是G，當(dāng)G基因突變后，GLB1蛋白的表達(dá)量減少，但預(yù)后變好。由此可見，SEZ6L2基因SNP rs75331747可能是致病SNP。

衰老是一種穩(wěn)定的生長停滯，損害了受損、陳舊或癌前細(xì)胞的復(fù)制，因此有助于組織的穩(wěn)態(tài)。衰老細(xì)胞在衰老過程中積累，與癌癥、纖維化和許多與年齡相關(guān)的疾病有關(guān)。衰老細(xì)胞的一個(gè)普遍特征是溶酶體β-半乳糖苷酶的活性升高，這已被用作衰老的標(biāo)志(衰老相關(guān)的β-氨基半乳糖苷酶活性)。GLB1增加與細(xì)胞不可逆生長停滯和衰老相關(guān)[17]。rs75331747通過影響β-半乳糖苷酶從而改變患者的生存期。

本研究樣本量較少，在一定程度上影響了檢驗(yàn)效能。因此，本研究結(jié)果需要更大樣本量的研究來進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究發(fā)現(xiàn)攜帶rs75331747 T基因型的ESCC患者，其生存結(jié)局更好，而關(guān)于其影響機(jī)制，目前尚未完全闡明，需要進(jìn)一步深入開展SNP功能學(xué)研究來解析其影響ESCC預(yù)后的分子機(jī)制[11]。

綜上所述，SEZ6L2基因SNP rs75331747可能影響ESCC患者的生存結(jié)局，可以作為今后ESCC患者生存結(jié)局的潛在預(yù)后標(biāo)志物。