郁勤龍 王蔚 陸斌斌 李正江 趙二科

隨著鑒定技術的發(fā)展，分枝桿菌種類日益增多，已達190多種。非結核分枝桿菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）是指除結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌以外的分枝桿菌。NTM主要感染人體肺臟、淋巴結、骨骼、皮膚和軟組織等，也可引起全身播散性疾病。目前NTM感染呈現(xiàn)快速增加的趨勢［1-2］，已成為危害人類健康的公共衛(wèi)生問題。全球NTM流行以鳥胞內分枝桿菌復合群（MAC）占據(jù)優(yōu)勢，各地NTM菌種分布和構成比存在差異，MAC中群內菌種構成比亦具有明顯地域差異［3］。且同種NTM可根據(jù)地域差異而呈現(xiàn)不同的致病力，因此分析本地區(qū)的NTM分離情況更有助于明確其臨床相關性［4］。本文分析2017～2019年嘉興地區(qū)NTM流行優(yōu)勢菌種及其變化、所轄縣區(qū)NTM流行情況，為本地區(qū)NTM防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2017年1月至2019年12月嘉興市第一醫(yī)院及所轄縣區(qū)結核定點醫(yī)院所有患者送檢的痰液、肺泡灌洗液、膿液等標本分離得到的疑似非結核分枝桿菌菌株。

1.2 儀器與試劑 BACTEC MGIT 320分枝桿菌培養(yǎng)儀及其配套試劑（美國BD公司），硝基苯甲酸（PNB）羅氏培養(yǎng)基與抗酸染色試劑（中國廣州珠海BASO有限公司），結核分枝桿菌抗原MPT64檢測試劑盒（韓國標準診斷股份有限公司），細菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化），OLYMPUS顯微鏡BX53（日本OLYMPUS）。

1.3 方法 （1）分枝桿菌初篩：參照2015年中國防癆協(xié)會《結核病實驗室檢驗規(guī)程》［5］對包括痰液、肺泡灌洗液、膿液、尿液、淋巴結穿刺液等各類標本采用N-乙酰半胱氨酸（NALC）-NaOH處理后，接種于BACTECT MGIT 320液體培養(yǎng)基進行液體快速培養(yǎng)，儀器報陽管經(jīng)抗酸染色確認抗酸陽性，MPT64膠體金測定陰性后，轉種PNB羅氏培養(yǎng)基生長者，初步判定為NTM。（2）分枝桿菌菌種鑒定：初篩為NTM樣本中吸取1 mL液體培養(yǎng)陽性菌液至1.5 mL離心管中，離心機離心半徑為8 cm，13,000 r/min離心5 min后棄去上清液，加入75%乙醇振蕩30 min滅活，重復離心棄上清，剩余沉淀中加入50μL核酸提取液混勻后，轉移至核酸提取管并振蕩5 min，置于95℃金屬浴中5 min后取出，將該核酸樣本交由杭州有康生物技術有限公司進行測序。鑒定方法采用16SrRNA、rpoB和hsp65基因序列片段檢測，16SrRNA基因序列長度495bp，測序 引 物F：5'-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3'，R：5'-TTACCGCGGCKGCTGGCAC-3'；hsp65基因序列長度439bp，測序引物F：5'-ACCAACGATGGTGTCTCCA-3'，R：5'-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3'；rpoB基因序列長度342bp，測序引物F：5'-CGACCACTTCGGCACCG-3'，R：5'-TCGATCGGGCACATCCGG-3'，測序結果提交NCBI-BLAST網(wǎng)站進行同源性對比分析，同源性≥97%認為結果可接受。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NTM感染病例菌種分布 本地區(qū)共分離到初篩為NTM感染菌株為309例，剔除重復患者共245例，其中奴卡菌感染3例，分別為皮疽奴卡菌2株和星狀奴卡菌1株，戈登氏菌感染1例為支氣管戈登菌，NTM感染共241例。241例NTM感染患者中單一感染238例，混合感染4例（結核分枝桿菌合并胞內分枝桿菌3例，胞內分枝桿菌合并堪薩斯分枝桿菌1例），包含13個菌種，以胞內分枝桿菌最為多見，其次為堪薩斯分枝桿菌與膿腫分枝桿菌，見表1。

表1 NTM菌種分布及其構成比

2.2 NTM感染患者基本情況 241例患者中男132例，女109例，比例為1.2∶1；患者年齡主要集中于41～65歲（34.4%）與＞65歲（53.9%）區(qū)間。0～17歲僅0.4%；職業(yè)以農民（56.0%）與務工人員（24.9%）為主；各縣區(qū)中NTM分離例數(shù)以南湖（22.8%）與嘉善（22.4%）較多，海寧（3.3%）較少，NTM分離種類以南湖（11種）與桐鄉(xiāng)（9種）較多。不同性別、年齡和職業(yè)NTM感染患者的菌種分布差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），不同縣區(qū)NTM感染患者的菌種分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 NTM主要優(yōu)勢菌種分離率變化 2017年至2019年本地區(qū)分離得到非結核分枝桿菌242株，NTM分離率：2017年13.4%；2018年15.6%；2019年17.3%，總分離率15.2%，主要優(yōu)勢菌種為胞內分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和膿腫分枝桿菌。2017年至2019年堪薩斯分枝桿菌呈下降趨勢（χ2=7.433，P＜0.01），胞內分枝桿菌與膿腫分枝桿菌無明顯變化（P＞0.05），見表2。

表2 2017年至2019年NTM優(yōu)勢菌種分離情況及變化

3 討論

非結核分枝桿菌廣泛存在于水、土壤和灰塵等環(huán)境中，多為條件致病菌。近年來隨著人口老齡化、免疫抑制劑使用增加及免疫缺陷病等原因［6］，NTM疫情日益嚴峻，同時感染死亡率亦明顯增加［7-8］。

本資料結果顯示，本地區(qū)NTM感染男性多于女性，以中老年農民為主，其次為務工人員，考慮與這兩大人群的生活條件和營養(yǎng)水平較差相關，其中農民分離率更高可能與NTM存在于水資源、土壤等環(huán)境中造成農民暴露機會的增加相關。所有NTM絕大部分為呼吸道樣本分離株，且以單一感染為主，混合感染少見，僅占1.7%。NTM總分離率為15.2%，高于全省整體水平4.69%［9］。NTM分離率從2017年的13.4%逐年升高至2019年的17.4%，形勢不容樂觀。2019年NTM分離數(shù)量絕對值雖有所減少但在分枝桿菌中所占比例升高，分析原因：①隨著本地區(qū)經(jīng)濟生活水平提高，人群整體結核病疫情有逐年下降趨勢；②隨著Gene Xpert MTB/RIF檢測技術的大規(guī)模推廣應用，部分結核病患者僅依靠Gene Xpert MTB/RIF檢測陽性進行診斷，并未進行分枝桿菌培養(yǎng)或培養(yǎng)陰性，從而造成結核分枝桿菌菌株檢出減少。

各縣區(qū)間NTM菌種流行情況無明顯差異。南湖區(qū)NTM分離數(shù)量及種類最多，可能與其為市本級區(qū)域，人口基數(shù)多且流動性大，表現(xiàn)為NTM檢出數(shù)量多且存在多樣性，而桐鄉(xiāng)市NTM分離總數(shù)量不多但種類較全，可能是當?shù)匕l(fā)達的勞務市場吸引大量的外來務工人員輸入所致。海寧市NTM分離較少，僅為3.3%，分析原因：一方面是由于基層醫(yī)院正逐步采用Gene Xpert MTB/RIF檢測代替分枝桿菌培養(yǎng)進行結核病診斷，導致NTM檢出機會降低；另一方面可能與其經(jīng)濟水平高于其他縣區(qū)，整體生活水平較高，NTM感染幾率下降有關。

NTM菌種分布存在明顯的地域差異，新加坡以膿腫分枝桿菌（49.9%）為主［10］；美國與日本以鳥胞內分枝桿復合群為主［11-12］；歐洲地區(qū)波蘭和斯洛伐克以堪薩斯分枝桿菌為主，占35%～36%，而匈牙利以蟾蜍分枝桿菌（49%）為主［3］。本資料結果顯示，本地區(qū)主要以胞內分枝桿菌（52.5%）為主，其次為堪薩斯分枝桿菌（19%）和膿腫分枝桿菌（18.6%）。杭州市（57.8%）［13］、紹興市（51.9%）［14］以胞內分枝桿菌為主要菌種，與本資料結果一致。深圳市以膿腫分枝桿菌（41.6%）為主［15］；海南地區(qū)以龜/膿腫分枝桿菌（41.5%）為主［16］，與本資料結果存在較大差異。NTM流行由于地理環(huán)境以及氣候等因素影響存在差異，因此不同地區(qū)感染者診斷治療時需進行菌種鑒定。

近3年所有分離得到的NTM中胞內分枝桿菌年分離率較為穩(wěn)定；膿腫分枝桿菌分離率無明顯趨勢性變化，但有略微提升；堪薩斯分枝桿菌出現(xiàn)明顯下降趨勢（P＜0.01）。堪薩斯分枝桿菌下降的原因可能為Gene Xpert MTB/RIF檢測的大力推行改變結核病的診斷模式，造成部分涂陽樣本無法獲得陽性菌株，而該菌對一線抗結核藥物耐藥率相對較低［17-18］，同時相關指南推薦堪薩斯分枝桿菌感染的優(yōu)先治療方案為利福平、乙胺丁醇和異煙肼［19-20］，因此堪薩斯分枝桿菌感染患者抗結核治療是有效的，可能被誤認為是結核分枝桿菌感染，而造成本地區(qū)堪薩斯分枝桿菌疫情的低估。

綜上所述，本地區(qū)NTM疫情處于較高水平，且呈升高趨勢，主要以胞內分枝桿菌為主，其次為堪薩斯分枝桿菌和膿腫分枝桿菌，且不同性別、年齡與職業(yè)感染人群NTM菌種分布存在差異，需根據(jù)既往感染患者的社會人口學及菌種分布特征，并結合當?shù)貙嶋H情況制定有效的防治策略與措施。另一方面結核病診斷模式改變易造成NTM漏檢而導致NTM感染診斷治療難度增加，臨床上應給予重視。因此推廣快速、準確、經(jīng)濟的NTM檢測新技術，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是本地區(qū)NTM防控的重點。