沈苗 嵇學(xué)仙 謝紅芳 姚根新 毛建英 潘建強(qiáng) 陳國群

我國乳腺癌的發(fā)病率占女性腫瘤的第1位，嚴(yán)重危害女性的身心健康［1］。Ki67是預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后較為重要且可靠的標(biāo)志物，Ki67高比例表達(dá)是預(yù)后的不良因素［2］。目前，我國大多數(shù)醫(yī)院的病理科醫(yī)師仍以顯微鏡目測評(píng)價(jià)Ki67指數(shù)，人為主觀性大。有效提高乳腺原位癌Ki67定量檢測的準(zhǔn)確性是研究者的共同目標(biāo)。本文探討人工智能（AI）技術(shù)在乳腺原位癌Ki67染色切片定量檢測中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧分析2013年1 月至2021年1月本院乳腺原位癌樣本110例，年齡36～84歲，平均年齡（52±4.5）歲。其中乳腺導(dǎo)管原位癌92例，占比83.6%（見圖1、2），乳腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀癌11例，占比10%（見圖3、4），乳腺實(shí)性乳頭狀癌7例，占比6.4%（見圖5、6）。所有Ki67免疫組化由有資質(zhì)的病理專業(yè)醫(yī)師作出判讀后再進(jìn)行AI檢測。

圖1 乳腺導(dǎo)管原位癌（HE×100倍）

圖2 乳腺導(dǎo)管原位癌（Ki67×100倍）

圖3 乳腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀癌（HE×100倍）

圖4 乳腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀癌（Ki67×100倍）

圖5 乳腺實(shí)性乳頭狀癌（HE×100倍）

圖6 乳腺實(shí)性乳頭狀癌（Ki67×100倍）

1.2 方法 （1）組織標(biāo)本的制備：選擇乳腺導(dǎo)管原位癌的蠟塊制備成 3μm 厚的切片免疫組化染色。免疫組化染色試劑盒和Ki67單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒，購自福建邁新生物技術(shù)有限公司。（2）免疫組化檢測［3］：乳腺原位癌標(biāo)本免疫組化采用 En Vision二步法檢測 Ki67 蛋白的表達(dá)情況，以TBS代替一抗作陰性對(duì)照，以試劑盒陽性片作陽性對(duì)照。選取經(jīng)蘇木精－伊紅（HE）染色驗(yàn)證的乳腺原位癌組織石蠟塊，切出石蠟3μm，將其放到載玻片上，以60℃烤片4 h；2次二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水后進(jìn)行水洗；修復(fù)抗原，蒸餾水沖洗，5 min×3次；3% H2O2溶液處理15 min，PBS沖洗，5 min×3次；一抗4 ℃孵育12 h，PBS沖洗，5 min×3次；二抗25℃孵育30 min，PBS沖洗，5 min×3 次；DAB室溫下3～5 min顯色，蘇木素復(fù)染1～2 min細(xì)胞核，以梯度乙醇脫水，以二甲苯透明，以中性樹膠進(jìn)行封片，在鏡下觀察。每張切片由2位病理專家獨(dú)立閱片共同協(xié)商出判斷結(jié)果。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) （1）Ki67陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：Ki67 蛋白陽性染色定位于細(xì)胞核，顆粒呈棕黃色。每張切片觀察5個(gè)具有代表性的視野（×400），每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算Ki67陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的比例［4］。參考NCCN指南及多項(xiàng)研究報(bào)道，包括浸潤性和非浸潤性乳腺癌，選擇14%作為Ki67表達(dá)的臨界值，將乳腺原位癌病例分為Ki67比表達(dá)組（≤14%）和高表達(dá)組（＞14%）［5～6］。

1.4 AI檢測 （1）AI和圖像定量分析相結(jié)合對(duì)乳腺原位癌Ki67切片的掃描分析。AI系統(tǒng)采用浙江賽爾微因公司生產(chǎn)的數(shù)字化智能細(xì)胞組織病理圖像分析軟件。制作的免疫組化Ki67片使用寧波江豐公司的數(shù)字圖片掃描技術(shù)。整個(gè)過程采用產(chǎn)品說明書操作。（2）110例乳腺原位癌Ki67病例，用該軟件的乳腺原位癌Ki67切片掃描成像并圈出癌癥區(qū)域。掃描10個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域得出的平均數(shù)值后得出結(jié)果。然后將這些數(shù)字圖像匯集，存入數(shù)據(jù)庫中。軟件在后期分析圖像時(shí)，會(huì)使用數(shù)據(jù)庫中的圖像數(shù)據(jù)。若軟件在分析時(shí)，出現(xiàn)癌癥區(qū)域漏圈或錯(cuò)圈，則由醫(yī)師進(jìn)行標(biāo)注漏圈和錯(cuò)圈部分，再存入數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行訓(xùn)練，以此達(dá)到完善數(shù)據(jù)的目的。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)數(shù)資料用%表示，用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 110例乳腺原位癌Ki67樣本檢測結(jié)果 見表1。

表1 110例乳腺原位癌Ki67樣本檢測結(jié)果

表1 （續(xù)）

2.2 Ki67＞14%與Ki67≤14%的 檢 測 結(jié) 果 比較 Ki67＞14% AI閱片與人工閱片陽性比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），AI閱片有更高的敏感性。Ki67≤14% AI閱片和人工閱片陽性比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、2。

圖1 Ki67＞14%的檢測結(jié)果比較

2.3 閱片時(shí)間 Ki67人工閱片每例平均時(shí)間12.7 min。AI閱片每例平均時(shí)間10.9 min，二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 Ki67≤14%檢測結(jié)果比較

3 討論

乳腺癌是一種極具異質(zhì)性的疾病，即使同種分子分型的乳腺癌也有完全不同的預(yù)后。乳腺癌相同的期別也具有不同的生物學(xué)特性［7-8］。乳腺原位癌是乳腺癌的早期病變。通過手術(shù)切除，經(jīng)正規(guī)藥物治療等綜合治療，效果確切，可達(dá)到痊愈目的，且較少出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。乳腺原位癌如果不進(jìn)行治療，進(jìn)一步可發(fā)展為乳腺浸潤性癌，其治療以手術(shù)，放化療，靶向治療為主，預(yù)后及患者生存時(shí)間較差。

針對(duì)預(yù)后靶點(diǎn)的治療與防治能夠顯著提升患者預(yù)后及治療效果。已有研究顯示，Ki67作為乳腺癌病理診斷的分子標(biāo)志物，是敏感度較好的獨(dú)立指標(biāo)［9］。DE等［10］Meta分析顯示，Ki67陽性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞惡性程度高，增殖活躍，腫瘤生長速度快，侵襲及轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后差。近年來，AI技術(shù)應(yīng)用于病理圖像分析日益成熟［11］。有文獻(xiàn)提示AI閱片檢測結(jié)合人工閱片后提高篩查的敏感性同時(shí)保證特異性并明顯提高工作效率［12］。本資料結(jié)果顯示，Ki67＞14% 43例：AI閱片和人工閱片陽性比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AI閱片有更高的敏感性。Ki67≤14% 67例：AI閱片和人工閱片陽性比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。AI獨(dú)立使用于乳腺原位癌Ki67的篩查尚不成熟。

借用AI的識(shí)別和深度學(xué)習(xí)能力，幫助醫(yī)師審片更加精準(zhǔn)高效。AI在病灶區(qū)域識(shí)別速度上勝于人工操作，同時(shí)也有利于對(duì)Ki67的定量檢測進(jìn)行量化，使得檢測結(jié)果更加精準(zhǔn)，為后續(xù)對(duì)乳腺原位癌的治療方案提供客觀的病理診斷依據(jù)。有利于臨床醫(yī)師制定針對(duì)性的治療方案。

因此，乳腺癌原位癌Ki67染色切片定量檢測中的熱點(diǎn)確定對(duì)實(shí)現(xiàn)大數(shù)據(jù)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)人工智能有著深遠(yuǎn)意義。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的進(jìn)步及更大數(shù)據(jù)庫的建立使用，AI技術(shù)將有更廣闊的應(yīng)用前景。