姚洪鋒 呂彩萍 郭瑜佳 陳文泱 駱方軍 何玉領(lǐng)
我國每年蛇咬傷患者10~30萬人次,有較高的致殘率及致死性[1]。本地區(qū)地理環(huán)境適宜蛇類生長,尤以蝮蛇居多,每年發(fā)生蛇咬傷患者較多。蝮蛇咬傷后主要是蛇毒毒素或酶激活炎癥細胞,釋放炎癥介質(zhì)并引起過度炎癥反應(yīng),引起機體損傷,炎癥因子C反應(yīng)蛋白(CRP)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)等明顯升高[2]。過度的炎癥反應(yīng)引起機體生理、病理變化的同時,也影響機體的免疫平衡。目前關(guān)于蝮蛇咬傷患者免疫狀態(tài)變化及相應(yīng)機制的報道較少,但在類似的中毒反應(yīng)時可見淋巴細胞功能異常[3]。程序性死亡因子-1(programmed death-1,PD-1)作為免疫調(diào)控抑制因子,在感染、炎癥、自身免疫性疾病、腫瘤等疾病中發(fā)揮重要作用[4]。但在蝮蛇咬傷患者中PD-1的表達及與嚴重程度變化尚不清楚,本文探討蝮蛇咬傷患者T淋巴細胞亞群、PD-1的表達變化及在評估病情嚴重程度與預后中的價值。
1.1 臨床資料 2016年3月至2019年8月本院蝮蛇咬傷患者106例,根據(jù)《2018年中國蛇傷救治專家共識》[5]蛇咬傷嚴重度評分表分為輕度蝮蛇咬傷組75例與中、重度蝮蛇咬傷組31例;其中中、重度組中有23例患者經(jīng)治療康復后14 d隨訪復查。另選取同期本院體檢中心健康體檢者30例作為健康對照組。三組受試者性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(1)納入標準:①符合《2018年中國蛇傷救治專家共識》診斷標準,明確為蝮蛇咬傷,常規(guī)予以清創(chuàng)局封、季德勝蛇藥及抗蝮蛇毒血清治療;②在蛇咬傷后12 h內(nèi)入院;③未在外院就診,包括使用抗蛇毒血清等。(2)排除標準:①有自身免疫性疾病、細菌性感染、病毒性感染及其它可引起炎癥的基礎(chǔ)疾??;②合并有多器官功能障礙、昏迷、嚴重心、肝、腎、血液等系統(tǒng)疾病以及精神疾病。本項目經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,所有患者均簽署知情同意書。
1.2 方法 (1)標本采集:蝮蛇咬傷患者于入院時直接采集2支2 mL EDTA抗凝血,其中1支立即3,500 r/min,離心10 min分離血漿并保存于-70℃冰箱內(nèi),用于CRP、SAA、IL-6、IL-10、TNF-α檢測;另1支EDTA抗凝血立即完成T淋巴細胞亞群與PD-1分析。隨訪患者于隨訪當日空腹采集2支2 mL EDTA抗凝血。(2)血清CRP、淀粉樣蛋白A(SAA)檢測:均采用膠乳增強免疫比濁法檢測,根據(jù)試劑說明書要求設(shè)置檢測參數(shù);儀器為日立7600全自動生化分析儀,試劑:SAA為浙江愛康生物科技有限公司;CRP為安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司。(2)IL-10、IL-6、TNF-α:采用流式熒光法檢測,按試劑說明書要求檢測,儀器為BD Canto II,使用Diva軟件進行結(jié)果分析。試劑:江西諾德醫(yī)療器械有限公司的人Th1/Th2亞群檢測試劑盒。(4)CD3+、CD4+、CD8+:采用流式細胞術(shù)檢測,儀器:BD Canto II,試劑:BD 貨號。將全血50μL和抗體試劑20μL加入到BD管中,混勻后室溫靜置孵育15 min,加入500μL溶血劑,震蕩混勻后靜置5 min,上機檢測。使用BD Canto軟件進行數(shù)據(jù)采集與分析。(5)PD-1檢測:將獲得的外周血單個核細胞懸液以1×106/μL分裝于試管中,在單克隆抗體(20μL)和熒光素的共同作用下室溫培養(yǎng)20 min。檢測T淋巴細胞CD4+、CD8+細胞上CD279+表達量即為PD-1水平。所使用的CD3/CD4/CD8/CD279熒光單克隆抗體及其同型對照均購自美國BD Biosciences公司。加入500μL溶血劑,震蕩混勻并靜置5min,然后,細胞在1,500 r/min下離心5 min,用美國BD公司的 FACS CantoII流式細胞儀分析,BD FACS Diva 軟件進行數(shù)據(jù)采集與分析。
1.3 統(tǒng)計學分析 采用 SPSS19.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料用(±s)表示,兩組比較采用t檢驗,相關(guān)性分析采用Pearson檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 蝮蛇咬傷患者一般資料 見表1。
表1 蝮蛇咬傷患者一般資料
2.2 炎癥因子、T淋巴細胞亞群及PD-1結(jié)果分析 見表2、圖1。
表2 蝮蛇咬傷患者免疫功能分析(±s)
表2 蝮蛇咬傷患者免疫功能分析(±s)
注:與對照組比較,*P<0.05;與輕度組比較,#P<0.05
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2.3 各指標水平與蝮蛇咬傷患者SSS評分的相關(guān)性 CD4+/CD8+比值與蝮蛇咬傷嚴重程度呈負相關(guān),CRP、SAA、IL-6、TNF-α、IL-10、CD4+PD-1+均 與蝮蛇咬傷嚴重程度呈正相關(guān)(P<0.05),見表3。
表3 各指標水平與腹蛇咬傷SSS評分相關(guān)性分析
蝮蛇咬傷,主要表現(xiàn)為皮下出血、瘀斑,咬傷部位腫脹、疼痛,造成細胞破壞、組織壞死,肢體殘廢,嚴重者出現(xiàn)心功能不全、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)甚至多器官功能障礙綜合征(MODS)[6]。其中IL-6、TNF-α等炎性細胞因子釋放增加,且可用于臨床嚴重程度及療效評估[7],這與本資料結(jié)果一致。SANTHOSH等[8]發(fā)現(xiàn)通過毒蛇毒液誘導的細胞實驗中,IL-6、TNF-α水平均升高,同時,氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)明顯增強;在藏紅花預處理后的實驗組中,可見IL-6、TNF-α水平降低,氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)減弱。
在正常生理條件下,CD4+T細胞與CD8+T細胞的比例處于動態(tài)平衡,而在外界刺激下,CD4+/CD8+的平衡被打破,導致機體免疫內(nèi)環(huán)境紊亂。本資料結(jié)果顯示,蝮蛇咬傷患者CD4+T細胞百分數(shù)降低,CD8+T細胞百分數(shù)升高,且 CD4+/CD8+比值與病情嚴重程度呈負相關(guān),這可能是蝮蛇蛇毒毒素引起T淋巴細胞免疫調(diào)節(jié)失衡,進一步引起機體的免疫狀況和炎癥的進展。周克兵等[9]發(fā)現(xiàn)蛇咬傷后的炎癥變化與患者的免疫功能下降有關(guān),當重癥蝮蛇咬傷患者經(jīng)烏司他丁治療后隨著癥狀的改善CD4+和CD8+T細胞表達水平逐漸升高,其中以CD4+T細胞尤為明顯,同時細胞因子IL-6和TNF-α水平明顯降低,這與本資料中觀察到的變化情況一致,提示在蝮蛇咬傷時隨著病情的好轉(zhuǎn),T淋巴細胞免疫平衡逐漸恢復,炎癥減輕。類似的中毒引起淋巴細胞亞群變化的可見氯化氫氣體、甲胺磷農(nóng)藥中毒患者,CD4+表達量與中毒嚴重程度、炎癥反應(yīng)程度正相關(guān),致使機體免疫功能紊亂。
在免疫調(diào)節(jié)過程中,PD-1同樣起重要作用。本資料顯示,CD4+PD-1+在中重度蝮蛇咬傷患者中呈高表達,且與病情嚴重程度呈正相關(guān);經(jīng)治療后CD4+PD-1+表達明顯降低,同時炎癥因子水平明顯降低,CD4+T細胞表達明顯升高,可能為PD-1通過調(diào)節(jié)免疫平衡,抑制炎癥反應(yīng)。PD-1其主要表達于T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞等,且在活化的T淋巴細胞表面、樹突狀細胞(DC)和單核細胞中表達上調(diào),具有調(diào)節(jié)活化和效應(yīng)期淋巴細胞的功能,在抗炎、抗腫瘤過程中發(fā)揮重要作用。HIRAHARA等[10]發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中,疾病活動度高的患者有更高的PD-1水平,且隨著治療好轉(zhuǎn),PD-1水平逐漸降低,提示PD-1可作為SLE疾病活動度的標志物。在膿毒血癥患者外周血記憶性CD4+T淋巴細胞中存在高表達的PD-1水平,說明在炎癥過程中存在免疫抑制的現(xiàn)象[11]。韓輝等[12]發(fā)現(xiàn)Grave's病患者外周血CD4+、CD8+細胞中PD-1表達升高,促進甲狀腺濾泡上皮細胞活性,導致炎性細胞因子水平升高,加速GD的發(fā)生和發(fā)展。在惡性膠質(zhì)瘤中,PD-L1表達上調(diào),促使CD4+、CD8+T細胞增加,并加重了炎癥反應(yīng)[13]。賈煒煒等[14]在肝包蟲病合并HBV感染患者中證實了CD4+PD-1+的表達與肝功能損傷程度密切相關(guān),說明PD-1對T細胞的調(diào)節(jié)具有重要意義。在SIV病毒感染的動物模型中,促炎細胞因子TNF-α,IL-6顯著增加,PD-1在肺泡巨噬細胞(AM)上表達明顯增加,并與血漿病毒載量有明顯的相關(guān)性,表明PD-1表達通過調(diào)節(jié)AM的功能活性,參與疾病進展[15]。
綜上所述,蝮蛇咬傷后機體存在T淋巴細胞調(diào)節(jié)失衡并伴有細胞因子分泌紊亂,且與病情嚴重程度相關(guān)。PD-1表達與病情嚴重程度相關(guān),提示PD-1可能參與蝮蛇咬傷后機體免疫功能變化,這可為蝮蛇咬傷患者的進一步診治提供了新的思路。