張 靜，王剛獅，劉瑞霞，時(shí)寶凌，廉梅霞

（山西林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 太原 030009）

1 材料與方法

1.1 材料

選擇3種質(zhì)地具有明顯差異、代表不同生長(zhǎng)階段的山西野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi根作為材料，具體情況見(jiàn)表1。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基。

表1 3種野葛根外植體來(lái)源及質(zhì)地Tab.1 Source and textureof threewild Radix Puerariae explants

1.2 方法

將采集回的新鮮野葛根材料去掉葉片，用毛刷輕輕將根表面的泥土去掉，選擇根表皮完整、無(wú)破損的葛根作為試驗(yàn)材料。將其切成10 cm左右的根段，挑選粗細(xì)均勻、并各自分成6組（共18組）放入錐形瓶?jī)?nèi)，分別置于超凈工作臺(tái)，錐形瓶?jī)?nèi)分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%乙醇，晃動(dòng)30 s，再分別移入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、0.2%的HgCl2溶液中消毒8 min、10 min和12 min（見(jiàn)表2）。隨后，無(wú)菌水沖洗5次，用鑷子和手術(shù)刀去掉根兩端變黑的部分，將消毒后的外植體切成0.5 cm長(zhǎng)的小段，接種于MS培養(yǎng)基上。每瓶接種4塊消毒后的外植體，每個(gè)處理接種6瓶。置于25℃的人工氣候箱中，黑暗培養(yǎng)，每3 d觀察記錄1次外植體污染與愈傷組織誘導(dǎo)情況。

表2 葛外植體消毒滅菌處理Tab.Disinfection and sterilization of Radix Puerariae explants

2 結(jié)果

觀察發(fā)現(xiàn)，在接種后4 d，有些外植體的表面便開(kāi)始出現(xiàn)白色的霉菌菌絲，表明消毒不徹底。培養(yǎng)9 d，所有消毒未達(dá)標(biāo)的外植體表面均長(zhǎng)出白色菌絲體。外植體污染與愈傷組織誘導(dǎo)情況見(jiàn)圖1~圖3。

圖1 大同市靈丘縣產(chǎn)野葛外植體消毒滅菌試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of wild Radix Puerariae explants in Lingqiu County

圖3 晉城市澤州縣產(chǎn)野葛外植體消毒試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Resultsof wild Radix Puerariae explantsin Zezhou County

死亡率=未出現(xiàn)愈傷組織塊數(shù)/未污染的接種塊數(shù)

由圖1可知，脆、嫩、表皮淺褐色的大同靈丘野葛在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的HgCl2溶液中消毒8 min、10 min、12 min，雖然根細(xì)胞死亡率為0，但無(wú)法達(dá)到理想滅菌效果，污染率高達(dá)83.3%~67.5%；在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的HgCl2中，滅菌時(shí)間10 min，污染率雖減少為4.1%，但在殺死細(xì)菌等微生物的同時(shí)，植物根細(xì)胞也被殺死，死亡率為17.5%；當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%HgCl2消毒12 min時(shí)，污染率雖然0，但33.3%的外植體均被殺死。因此，脆、嫩、表皮淺褐色的大同靈丘野葛根的最佳消毒條件為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%乙醇處理時(shí)間30 s，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的HgCl2溶液浸泡8 min，此時(shí)，污染率為8.3%，死亡率為5%。

由圖2可知，堅(jiān)實(shí)、較嫩、表皮淺褐色的運(yùn)城平陸產(chǎn)野葛的最佳滅菌條件為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%酒精處理時(shí)間30 s，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的HgCl2溶液浸泡8 min。在此條件下外植體的污染率為10.2%，外植體死亡率為0。

圖2 運(yùn)城市平陸縣產(chǎn)野葛外植體消毒試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Resultsof wild Radix Puerariae explantsin Pinglu County

由圖3可知，堅(jiān)實(shí)、較硬、表皮粗糙、深褐色的晉城澤州產(chǎn)野葛的最佳滅菌條件為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%乙醇處理時(shí)間30 s，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%HgCl2溶液消毒10 min。在此條件下外植體的污染率為5.7%，死亡率為32.2%。

3 討論

組織培養(yǎng)的第一步是獲得無(wú)菌的外植體，而不同情況的外植體應(yīng)該選擇其適宜的滅菌試劑與方法，特別是珍貴、不易獲得的材料。若外植體消毒方法不當(dāng)，可能導(dǎo)致試驗(yàn)材料損失，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。因此，選用合適的消毒劑種類、濃度與滅菌時(shí)間是解決污染的關(guān)鍵[1]。常用的消毒試劑有質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%乙醇、HgCl2。質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%乙醇具有較強(qiáng)的穿透力與殺傷力，是最常用的表面消毒劑，但其對(duì)組織、細(xì)胞的傷害程度也高，通常與其他消毒劑配合使用[1]。HgCl2是目前殺菌效果最好的消毒劑，其殺菌原理是Hg+與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性[2]，從而殺死細(xì)菌等微生物，但HgCl2更易外植體表面殘留，汞又較難去除，因此，使用后需用無(wú)菌水沖洗多次，降低汞的殘留。本試驗(yàn)采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%乙醇配合不同濃度的HgCl2對(duì)不同來(lái)源的野葛外植體進(jìn)行消毒，均達(dá)到了理想的效果。其中大同靈丘產(chǎn)野葛，只需質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%乙醇處理時(shí)間30 s、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的HgCl2溶液消毒8 min即可達(dá)到理想效果；晉城澤州產(chǎn)野葛質(zhì)地較硬、根段中間深褐色、枯朽，代謝緩慢使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的HgCl2溶液消毒10 min，雖然可以殺滅絕大多數(shù)的體表微生物，污染率為5.7%，但外植體的1/3死亡。

在制定消毒方案時(shí)，還需要考慮到外植體的采集季節(jié)、所處的生理狀態(tài)等[3]。對(duì)于在野外、大田采集到的外植體，表面帶有大量的泥土，特別是根作為外植體污染率會(huì)更高，但考慮到野葛根中含有較高的次級(jí)代謝產(chǎn)物，有利于后期葛根素、異黃酮等有效成分的獲得，因此應(yīng)當(dāng)選擇生長(zhǎng)旺盛期、代謝快、顏色淺、質(zhì)地脆嫩的葛根作為外植體。在外植體采集時(shí)，還應(yīng)當(dāng)避免陰雨天等潮濕天氣，潮濕的空氣更加適合雜菌的生長(zhǎng)，從而增加外植體的污染率。在本試驗(yàn)中，大同市靈丘產(chǎn)的野葛根脆、嫩、表皮淺褐色，內(nèi)源激素充足、具有更強(qiáng)的抗菌能力；而晉城澤州產(chǎn)野葛處于生長(zhǎng)衰退階段，深褐色、枯朽，不僅污染率高，外植體活性較弱、抗逆性差，不是理想的外植體材料。