郭艷紅 吳琴寧 鄧權(quán) 周強

(貴州省第二人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550000)

鎘是一種具有廣泛用途的金屬元素，可用于電鍍、充電電池、制造電工合金等，與人類生活息息相關(guān)[1]。但鎘及化合物均有一定的生物毒性，若受污染的土壤或水體被動植物吸收后，沿著食物鏈進入人體，將對機體組織器官產(chǎn)生毒性損傷[2]。腎臟是鎘主要的蓄積部位，其與硫基類蛋白形成的復(fù)合物可對腎小管和腎小球產(chǎn)生不可逆的損傷[3]。關(guān)于鎘誘導(dǎo)的腎損傷機制有較多報道，大多認為與細胞凋亡、氧化損傷有關(guān)[4-5]，但其作用機制尚不完全清楚。Twinfilin-1屬于肌動蛋白結(jié)合蛋白家族成員，在細胞骨架重塑過程中發(fā)揮重要作用，與細胞結(jié)構(gòu)形成及細胞凋亡等病理生理過程密切相關(guān)[6]。但國內(nèi)Twinfilin-1與鎘誘導(dǎo)腎損傷的相關(guān)研究較少，本研究將探究鎘誘導(dǎo)腎細胞重金屬中毒中Twinfilin-1基因的表達及其對細胞凋亡的影響，這對于明確鎘誘導(dǎo)腎細胞凋亡機制具有重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 細胞株來源 豬腎細胞LLC-PK1購于美國組織培養(yǎng)庫ATCC。

1.2 主要試劑與儀器 氯化鎘(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)，取1 g氯化鎘溶于4.4 mL雙蒸水制備為1 mol/L鎘母液，脂質(zhì)體2000試劑盒(美國Invitrogen)，CCK8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒、JC-1探針(美國BD)，GAPDH、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase3、9)、切割后Caspase3、9(cleaved cas3、9)抗體(美國Abcam)，pc DNA空載體、pc DNA-Twinfilin-1質(zhì)粒由上海生工生物股份有限公司提供，Twinfilin-1基因引物由上?；鶢栴D生物科技有限公司提供，熒光PCR儀、凝膠成像儀(美國Bio-Rad)，流式細胞儀(美國BD)。

1.3 細胞培養(yǎng) 將豬腎細胞LLC-PK1均勻懸浮于含有5%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細胞貼壁密度達80%～90%時傳代培養(yǎng)，取狀態(tài)良好的細胞用于后續(xù)實驗。

1.4 細胞分組與處理 稀釋1 mol/L鎘母液至8 μmol/L，處理細胞24 h建立重金屬中毒模型[7]，將細胞隨機分為對照組、模型組、模型+pc DNA空載體組、模型+Twinfilin-1過表達組。模型+pc DNA空載體組、模型+Twinfilin-1過表達組參照脂質(zhì)體2000試劑盒操作，將pc DNA空載體、pc DNA-Twinfilin-1轉(zhuǎn)染細胞48 h，收集細胞通過實時熒光PCR技術(shù)和蛋白印跡實驗驗證轉(zhuǎn)染效果。

1.5 實時熒光PCR技術(shù)檢測Twinfilin-1 mRNA表達水平 采用Trizol試劑提取細胞中總RNA，再逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Twinfilin-1上游引物序列為5’-GCGUGGUCUCCUGAUCAUUTT-3’，下游引物序列為5’-CCCAAAGAUGCAGCACGUUTT-3’。PCR條件：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性30 s，60℃退火45 s，JP總40個循環(huán)。采用2-△△Ct相對定量法，以GAPDH為內(nèi)參，計算Twinfilin-1 mRNA的相對水平。

1.6 蛋白印跡檢測相關(guān)蛋白水平 采用RIPA裂解液提取細胞中總蛋白，經(jīng)BCA法測定蛋白濃度，取70 μg變性蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白分離后切取目的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，取出PVDF膜經(jīng)5%脫脂牛奶室溫孵育2 h，封閉非特異性位點，再置于1:1000蛋白一抗中4℃孵育過夜，接著置于1:8000蛋白二抗中37℃孵育1 h，最后添加ECL發(fā)光試劑，置于凝膠成像儀上成像，通過Quantity One軟件對蛋白條帶進行灰度分析。

1.7 CCK8實驗檢測細胞增殖 將各組細胞接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24、48、72、96 h，向孔中添加含有10% CCK8試劑的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于450 nm處檢測各孔吸光度值。

1.8 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集各組細胞，調(diào)整濃度至1×109/L，取100 μL細胞懸液分別加入Annexin V-FITC、PI染液各5 μL，室溫下避光孵育30 min，再添加400 μL結(jié)合緩沖液，混勻后上流式細胞儀檢測，計算凋亡細胞占細胞總數(shù)的百分比。

1.9 流式細胞儀檢測細胞線粒體膜電位的變化 收集各組細胞，調(diào)整濃度至1×109/L，取100 μL細胞懸液加入10 mg/L JC-1探針，37℃孵育30 min，采用流式細胞儀檢測。正常線粒體內(nèi)JC-1聚集于線粒體基質(zhì)中形成聚合物，呈紅色熒光，而受損線粒體由于膜電位下降或喪失，JC-1只能以單體形式存在于胞漿，呈綠色熒光。

2 結(jié)果

2.1 LLC-PK1細胞轉(zhuǎn)染情況 實時熒光PCR技術(shù)和蛋白印跡檢測細胞中Twinfilin-1的表達結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組Twinfilin-1 mRNA及蛋白水平降低(P<0.05)；與模型組比較，模型+Twinfilin-1過表達組Twinfilin-1 mRNA及蛋白水平增加(P<0.05)，而模型組+pc DNA空載體組無明顯變化(P>0.05)，見圖1。

圖1 LLC-PK1細胞轉(zhuǎn)染情況Figure 1 Transfection of LLC-PK1 cells注：Ⅰ.實時熒光PCR技術(shù)檢測Twinfilin-1 mRNA水平，Ⅱ.蛋白印跡檢測Twinfilin-1蛋白水平；A.對照組，B.模型組，C.模型+pc DNA空載體組，D.模型+Twinfilin-1過表達組；與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

2.2 Twinfilin-1過表達對細胞增殖的影響 CCK8實驗檢測細胞增殖能力結(jié)果顯示，培養(yǎng)96 h時，與對照組比較，模型組細胞增殖能力降低(P<0.05)；與模型組比較，模型+Twinfilin-1過表達組細胞增殖能力增加(P<0.05)，而模型組+pc DNA空載體組無明顯變化(P>0.05)，見圖2。

圖2 Twinfilin-1過表達對細胞增殖的影響Figure 2 Twinfilin-effect of overexpression of bcl-1 on cell proliferation注：A.對照組，B.模型組，C.模型+pc DNA空載體組，D.模型+Twinfilin-1過表達組；與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

2.3 Twinfilin-1過表達對細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組細胞凋亡率增加(P<0.05)；與模型組比較，模型+Twinfilin-1過表達組細胞凋亡率降低(P<0.05)，而模型組+pc DNA空載體組無明顯變化(P>0.05)，見圖3。

圖3 Twinfilin-1過表達對細凋亡殖的影響Figure 3 The effect of overexpression of twinfilin-1 on apoptosis注：Ⅰ.流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平，Ⅱ.各組細胞凋亡率的比較；A.對照組，B.模型組，C.模型組+pc DNA空載體組，D.模型+Twinfilin-1過表達組；與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

2.4 Twinfilin-1過表達對凋亡相關(guān)蛋白水平的影響 蛋白印跡檢測凋亡相關(guān)蛋白水平結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組細胞中Bax/Bcl-2、cleaved cas9/cas9及cleaved cas3/cas3水平增加(P<0.05)；與模型組比較，模型+Twinfilin-1過表達組Bax/Bcl-2、cleaved cas9/cas9及cleaved cas3/cas3水平降低(P<0.05)，而模型組+pc DNA空載體組無明顯變化(P>0.05)，見圖4。

圖4 Twinfilin-1過表達對凋亡相關(guān)蛋白水平的影響Figure 4 Effect of twinfilin-1 overexpression on the expression of apoptosis related proteins注：Ⅰ.蛋白印跡檢測凋亡相關(guān)蛋白水平，Ⅱ.各組細胞中Bax/Bcl-2、cleaved cas9/cas9及cleaved cas3/cas3水平的比較；A.對照組，B.模型組，C.模型組+pc DNA空載體組，D.模型+Twinfilin-1過表達組；與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

2.5 Twinfilin-1過表達對細胞線粒體膜電位的影響 流式細胞術(shù)檢測細胞線粒體膜電位的變化結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組細胞線粒體膜電位降低(P<0.05)；與模型組比較，模型+Twinfilin-1過表達組線粒體膜電位升高(P<0.05)，而模型組+pc DNA空載體組無明顯變化(P>0.05)，見圖5。

圖5 Twinfilin-1過表達對細胞線粒體膜電位的影響Figure 5 Effect of twinfilin-1 overexpression on mitochondrial membrane potential注：Ⅰ.流式細胞術(shù)檢測細胞線粒體膜電位的變化，Ⅱ.各組細胞線粒體膜電位的比較；A.對照組，B.模型組，C.模型組+pc DNA空載體組，D.模型+Twinfilin-1過表達組

3 討論

鎘在體內(nèi)半衰期長達30～40年，且極易在人體內(nèi)積聚，具有嚴(yán)重的致畸性和致癌性[8]。人體鎘暴露后，主要表現(xiàn)為腸胃炎、肝功能異常、腎炎和骨質(zhì)疏松等；腎臟被認為是鎘毒性的主要靶器官，其毒性損傷影響機制尚無定論[9]。研究顯示，電鏡下觀察腎細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，隨著鎘濃度的增加，腎細胞的凋亡率也升高[10]。活性氧所致的氧化應(yīng)激損傷，被認為是造成腎細胞凋亡的重要環(huán)節(jié)，鎘可作用于線粒體產(chǎn)生大量活性氧，并抑制抗氧化系統(tǒng)酶活性，大量活性氧的堆積將破壞線粒體膜的通透性，引起線粒體膜電位下降，最終導(dǎo)致腎臟細胞的凋亡[11]。同時，脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物丙二醛可生成聚合物，與人體內(nèi)蛋白質(zhì)、脫氧核糖核酸發(fā)生反應(yīng)，從而誘發(fā)細胞凋亡[12-13]。另外，鎘對巰基有高親和力，其與巰基蛋白結(jié)合，進而致線粒體膜功能紊亂，釋放凋亡誘導(dǎo)因子而引起細胞凋亡[14]。

Twinfilin-1普遍存在于植物細胞以外的所有真核細胞中，可調(diào)控胞內(nèi)彈性纖維的長度與排序，對于維持細胞形態(tài)、細胞結(jié)構(gòu)、能量轉(zhuǎn)換、細胞增殖、凋亡等動態(tài)運動有重要作用[15]。Li等[16]研究顯示，Twinfilin-1在牛乳腺上皮細胞中受氨基酸和激素的誘導(dǎo)，可通過mTOR通路調(diào)控乳汁的生物合成和牛乳腺上皮細胞增殖。Sun等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-30c可靶向抑制Twinfilin-1，抑制胰腺癌細胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。本研究探討了Twinfilin-1在鎘誘導(dǎo)腎細胞重金屬中毒發(fā)生中的作用，以LLC-PK1細胞為研究對象，經(jīng)鎘處理后發(fā)現(xiàn)細胞中Twinfilin-1表達下調(diào)，同時，細胞增殖、凋亡檢測結(jié)果表明，Twinfilin-1過表達后可明顯逆轉(zhuǎn)鎘誘導(dǎo)的腎細胞增殖能力降低、凋亡率升高及線粒體膜電位下降。推測Twinfilin-1可能是鎘誘導(dǎo)腎細胞重金屬中毒發(fā)生中的一個關(guān)鍵因素。

細胞凋亡過程涉及到凋亡相關(guān)蛋白表達的改變，Bcl-2蛋白家族是線粒體膜蛋白，Bax/Bcl-2是啟動細胞凋亡的分子開關(guān)，其激活內(nèi)源性線粒體凋亡信號通路，將引起線粒體因子的釋放，進而活化Caspase蛋白家族，最終啟動細胞凋亡[18-20]。進一步在蛋白分子水平探索Twinfilin-1過表達后引起凋亡/增殖失衡的機制結(jié)果顯示，與模型組比較，Twinfilin-1過表達組Bax/Bcl-2、cleaved cas9/cas9及cleaved cas3/cas3水平降低，提示Twinfilin-1過表達可能通過下調(diào)Bax/Bcl-2水平，抑制Caspase3、9的活化，減少鎘誘導(dǎo)腎細胞凋亡，但Twinfilin-1是直接還是間接影響上述蛋白表達還不清楚，仍有待深入分析。

4 結(jié)論

Twinfilin-1過表達可能通過下調(diào)凋亡關(guān)鍵因子Bax/Bcl-2水平，抑制Caspase3、9的活化，減少細胞凋亡，維持正常線粒體膜電位，從而保護鎘誘導(dǎo)腎細胞重金屬中毒，這為鎘中毒患者的臨床治療提供了一定的理論依據(jù)。