羅燁 李明星 陳曉梅 朱雨潔 何婧

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院超聲醫(yī)學科，四川 瀘州 646000)

失血性休克是臨床常見的急危重癥，是全身炎癥和器官損傷的主要驅動因素，腎臟常因失血性休克的強烈影響造成急性腎損傷；治療失血性休克首選方法即為補液，以便盡快恢復血容量，而腎臟損傷反而加重，這種病理現象稱為失血性休克再灌注損傷(Hemorrhagic shock and reperfusion injury，HS-RI)[1]。研究[2-3]表明，強力霉素是四環(huán)素類藥物，除具有抗菌作用外，也能改善失血性休克復蘇后的腎損傷。本研究擬通過制備SD大鼠急性重度失血性休克液體復蘇期模型，使用超聲造影TIC參數評估強力霉素改善失血性休克復蘇期再灌注損傷后腎皮質血流灌注的改變，分析TIC參數與實驗室指標的相關性，探討TIC參數在評估強力霉素治療腎HS-RI的應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SPF級雄性SD大鼠24只，8～10周齡，體質量(300±50)g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK(川)2020-03，于恒溫動物房(25℃)適應性喂養(yǎng)7天，自由進食飲水，術前6 h禁食禁飲。隨機將大鼠分為假手術組(Sham組)、失血性休克再灌注組(HS-RI組)和強力霉素干預組(Dox組)，每組8只。Dox組于術前30 min給予10 mg/kg強力霉素經尾靜脈注入，Sham組及HS-RI組注入等量生理鹽水。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 動物模型建立 腹腔注射肝素鈉溶液 (10 mg/kg)全身肝素化，15 min后腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，頸部及右側腹股溝區(qū)備皮，仰臥位固定，用鑷子牽出鼠舌，防止舌后綴，碘伏消毒備皮區(qū)域。沿頸部正中切開皮膚，逐層鈍性分離，游離出左側頸總動脈，置入20G 留置針并固定，經三通管連接生物多導生命監(jiān)測儀，待顯示屏上血壓曲線穩(wěn)定時，記錄此時的數值作為原始平均動脈壓(Mean arterial pressure，MAP)。以同樣的方法分離出右側股總動脈，置入24G留置針作為放血通道，放血至40% MAP，維持 1 h，建立重度失血性休克定壓模型，左側股總靜脈置入24G留置針作為補液通道，復蘇液為2:1的乳酸鈉林格注射液和羥乙基淀粉130/0.4氯化鈉注射液，通過補液通道輸入復蘇液至血壓回升至80%MAP，再灌注模型建立成功，拔管、結扎血管，縫合皮膚，術后大鼠清潔飼養(yǎng)，自由飲水進食。Sham組未行放血及補液處理，其他手術操作與兩組相同。

1.3 超聲造影檢查 所有大鼠于術后24 h后水合氯醛麻醉，右側腎區(qū)及左側腹股溝區(qū)剃毛并固定。分離出左側股總靜脈并置入24G留置針，建立推注超聲造影劑通道。采用Siemens ACUSON S3000 超聲診斷儀，9L4變頻線陣探頭，在二維模式下掃查右腎，將探頭置于最大冠狀切面，轉換為造影模式，設置相關參數：頻率5.0MHz，深度4.0 cm，機械指數(MI)0.07，超聲造影劑采用sonovue，使用5 mL生理鹽水配置成六氟化硫(SF6)微泡混懸液，經左側股總靜脈置管按0.4 mL/kg劑量團注，隨即注入0.5 mL生理鹽水沖管，連續(xù)觀察右腎造影3 min，并保存動態(tài)圖像。通過超聲診斷儀內置分析軟件(Auto tracking contrast quantification，ACQ)進行定量分析，選取同一深度、與聲束垂直、面積為0.05 mm2的腎皮質區(qū)中份為感興趣區(qū)域(ROI)，繪制時間-強度曲線(Time-intensity curve，TIC)并獲取相關參數，包括峰值強度(peak intensity，Peak)、達峰時間(Time to peak，TP)、曲線下面積(Area under the curve，AUC)及平均渡越時間(Mean transition time，MTT)。所有參數由同一操作者測量3次，取平均值。

1.4 腎功能檢查 超聲造影結束后，通過下腔靜脈取血3 mL，離心后取上層血清，用于檢測血肌酐(Creatinine，Crea)及尿素氮(Urea nitrogen，Urea)水平。

1.5 病理學檢查 取血結束后，經左側股總靜脈置管注入空氣處死大鼠，迅速取大鼠右腎組織，沿冠狀面均分為兩份，一份用10%中性甲醛固定液固定，石蠟包埋，切片后行HE染色，鏡下觀察病理形態(tài)改變；另一份用ELISA法檢測基質金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9，MMP-9)及腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平。

2 結果

2.1 各組大鼠超聲造影TIC及相關參數比較 通過對3組大鼠超聲造影繪制TIC整體分析可見，Sham組TIC上升快速達峰，達峰后快速下降至基礎水平；HS-RI組及Dox組TIC上升至峰值及下降較Sham組明顯減慢；Dox組TIC較HS-RI組上升及下降均有明顯增快，見圖1。與Sham組比較，HS-RI組和Dox組的Peak、AUC增加，TP、MTT延長(P<0.05)；與HS-RI組比較，Dox組Peak、AUC減小，TP、MTT縮短(P<0.05)，見表1。

圖1 各組大鼠腎皮質血流灌注TIC圖Figure 1 TIC diagram of renal cortical blood perfusion in each group注：A.Sham組；B.HS-RI組；C.Dox組

表1 各組大鼠腎皮質TIC參數比較Table 1 Comparison of TiC parameters in renal cortex of rats in each group

2.2 各組大鼠腎功能結果比較 與Sham組比較，HS-RI組和Dox組的血Crea及Urea水平升高(P<0.05)；與HS-RI組比較，Dox組Crea及Urea水平降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠Crea及Urea比較Table 2 Comparison of Crea and Urea of rats in each group

2.3 各組大鼠腎組織MMP-2、MMP-9和TNF-α水平 與Sham組相比，HS-RI組和Dox組大鼠腎組織勻漿中的MMP-2、MMP-9及TNF-α水平升高，除Dox組中的MMP-9水平比較差異無統計學意義，余指標經較差異均有統計學意義(P<0.05)。與HS-RI組相比，Dox組中的MMP-2、MMP-9及TNF-α水平降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腎組織MMP-2、MMP-9和TNF-α水平比較Table 3 Comparison of MMP-2，MMP-9 and TNF-α in renal tissue of rats in each group

2.4 TIC參數與實驗室指標相關性分析 TP、MTT及AUC與Crea、Urea、MMP-2及TNF-α呈高度正相關(P<0.05)；TP、MTT及AUC與MMP-9呈中度正相關；Peak與Crea、Urea、MMP-2、MMP-9及TNF-α呈中度正相關(P<0.05)，見表4。

表4 TIC參數與實驗室指標相關性分析Table 4 Correlation between TIC parameters and laboratory indexes

2.5 病理結果 Sham組腎皮質腎小球結構完整清晰，腎小管排列整齊，未見變性或壞死，間質無異常改變；HS-RI組部分腎小管上皮細胞腫脹、壞死，局部腎小管內可見蛋白管型，間質內可見少許炎細胞浸潤；Dox組部分腎小管上皮細胞腫脹、空泡樣變，間質偶見少許炎細胞浸潤，見圖2。

圖2 各組大鼠腎臟病理圖(200×)Figure 2 Renal pathology of rats in each group注：A.Sham組；B.HS-RI組；C.Dox組

3 討論

失血性休克是一種低血容量性休克，全球每年估計有190萬人死亡，其中150萬人死于身體創(chuàng)傷，導致休克的出血原因差異很大，包括創(chuàng)傷、產婦出血、胃腸道出血、圍手術期出血和動脈瘤破裂等[4]。盡管通過液體復蘇恢復了血流動力學，但失血性休克和復蘇后可能發(fā)展為系統性炎癥反應綜合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，導致多器官損傷和功能障礙即多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。腎臟血供豐富，缺乏側枝循環(huán)，再灌注過程更易損傷。腎臟血流動力學的改變可影響腎功能，腎皮質的血流灌注量占腎血流量的90%，因此檢測腎皮質血流灌注的變化可以間接反映腎損傷程度[5-6]。超聲造影技術能動態(tài)檢測宏觀血流及微循環(huán)改變[7]，目前有許多文獻報道了超聲造影技術鑒別在甲狀腺結節(jié)、肝腫物、前列腺結節(jié)等良惡性的應用，超聲造影能顯示腫瘤內微血管的分布圖像，獲得關于細小血管的相關信息[8-10]。超聲造影劑SonoVue主要成分是SF6微泡，直徑1～5 μm，不含人體蛋白成分，在血液中穩(wěn)定性好，能進入各組織器官的毛細血管網，不進入組織間隙，15 min幾乎全部經呼吸排除，不經肝腎代謝，無肝腎禁忌，是理想的血池顯像劑。與核醫(yī)學、MRI及CT等檢查技術比較，超聲造影技術評估組織血流灌注具有操作簡單、重復性好、費用低、無放射性及腎毒性等優(yōu)勢。

TP反映造影劑開始注入至峰值強度的時間，MTT反映了造影劑開始注入至廓清到峰值強度一半的時間。HS-RI的主要機制與炎癥反應、細胞凋亡、微循環(huán)障礙、鈣超載等有關[11-14]，HS-RI發(fā)生后在過量的氧自由基、TNF-α、IL1-β等誘發(fā)下，內皮細胞、成纖維細胞及白細胞等細胞內MMP-2和MMP-9表達上調，導致毛細血管內皮功能障礙、破壞毛細血管基底膜與內皮細胞的緊密連接及降解細胞外基質，使血漿向組織間隙滲出，引起血液濃縮，造成血流的粘滯狀態(tài)[15-17]；同時MMP-2和MMP-9進一步激活的炎癥因子如IL-1、TNF-α、TGF-β等大量釋放，加劇炎癥反映，導致內皮細胞上黏附大量白細胞，引起腎皮質微循環(huán)障礙[18]，造成了腎皮質血流灌注減慢。因此超聲造影微泡在腎皮質中的灌注速度和廓清速度減慢，在TIC參數上表現為TP與MTT延長。AUC是反映ROI內一段時間內的造影劑累積總積分值，HS-RI導致大量炎癥細胞淤積于毛細血管內，炎癥細胞對造影劑微泡有一定的吞噬作用，被吞噬的造影劑保持聲學活性可被檢測，而且造影劑微泡廓清速度的減慢，因此TIC參數表現為AUC值增大[19]。Peak代表了ROI中造影劑達到峰值時的信號強度，與造影劑微泡的灌注速度、廓清速度及炎癥細胞的吞噬作用有關，在TIC參數中Peak值也表現為增大。研究表明，作為外源性的基質金屬蛋白酶抑制劑，強力霉素可以改善腎HS-RI引起的炎癥反應、氧化應激及細胞凋亡，最重要的是能降低MMP-2和MMP-9的含量與活性[20-22]。Peak值作為反映造影劑達到峰值時的信號強度的瞬時指標，無不明顯累積效應，不能較好反映藥物干預前后腎皮質血流灌注的改變，因此Peak值不能作為評估腎皮質血流灌注變化的參數[23]。強力霉素對MMP-2和MMP-9的抑制可以改善內皮細胞功能障礙、維持毛細血管基底膜完整及降低微循環(huán)阻力，使得腎皮質血流灌注得以改善，因此造影劑微泡在腎皮質中的灌注及廓清速度增快，在Dox組TIC參數上表現為TP和MTT縮短，同時強力霉素能改善炎癥反應，降低炎癥細胞對超聲造影劑的吞噬作用，故在TIC參數上表現為AUC及Peak值的降低。本研究結果表明，HS-RI組大鼠腎皮質血流灌注出現明顯改變，與Shams組相比，在TIC參數上表現為TP、MTT延長，Peak、AUC增加，這與孫曉穎等[24]的實驗結果一致。

血清Crea和Urea指標作為臨床工作中常用的評估腎臟功能指標，但腎臟的代償能力強，在腎損傷早期Crea和Urea依然能維持在正常水平[25]。超聲造影可以更敏感、精確地反映急性腎損傷早期腎臟血流灌注狀態(tài)，因此超聲造影相關參數在腎損傷早期就會出現改變[26]，在反映腎功能改變較血清Crea和Urea具有更高靈敏度。本研究中HS-RI組病理組織切片表現為部分腎小管上皮細胞腫脹、壞死，蛋白管型及炎細胞浸潤，血清Crea及Urea水平較Sham組明顯升高(P<0.05)，腎組織勻漿中MMP-2、MMP-9及TNF-α水平也較Sham組升高(P<0.05)；Dox組病理表現為部分腎小管上皮細胞腫脹、空泡樣變，偶見少許炎細胞浸潤，Crea、Urea、MMP-2、MMP-9及TNF-α等指標較HS-RI組顯著改善(P<0.05)。病理及實驗室指標結果證實強力霉素對失血性休克液體復蘇后的腎再灌注損傷有保護作用。將TIC參數與Crea、Urea、MMP-2、MMP-9及TNF-α等指標進行Pearson相關性分析發(fā)現，各TIC參數與腎功能指標Crea及Urea呈顯著正相關(P<0.01)，即Crea及Urea值越高，各TIC參數值越大；各TIC參數與MMP-2、MMP-9及TNF-α也呈顯著正相關(P<0.01)，即MMP-2、MMP-9及TNF-α值越高，各TIC參數值越大，這表明各TIC參數與各實驗室指標間具有很強的平行性，TIC參數能在一定程度上反映腎功能變化。

有研究[2]報道，強力霉素在急性失血性休克液體復蘇之前和之后給予有相似的保護作用，具有減輕出血后腎損害的臨床療效。在本研究中，強力霉素在復蘇前給予，實驗結果也顯示了強力霉素對腎臟的保護作用。本實驗不足之處:①動物樣本量相對較少。②本實驗通過麻醉及全身肝素化建立的重度失血性休克液體復蘇模型與實際臨床情況有所出入。③僅選擇24 h一個時間點作為研究較為局限。目前這類實驗研究較少，若想確定診斷腎功能損傷程度的TP、MTT及AUC的有效閾值，則還需進一步的研究。

4 結論

強力霉素可以減輕失血性休克液體復蘇后腎功能損傷，改善腎皮質血流灌注，超聲造影TIC參數如TP、MTT與AUC可定量評估藥物干預前后腎皮質血流灌注變化情況，有望為臨床早發(fā)現、早干預該類疾病提供一種新的方法。