許樂(lè)宜 張敏 孔令軍 王靜予 費(fèi)智敏

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203)

腦膠質(zhì)瘤是發(fā)病于成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)的原發(fā)性實(shí)體瘤，占原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡心腫瘤的46.1%，世界衛(wèi)生組織(WHO)依據(jù)其病理特點(diǎn)將之分為4級(jí)，分別為Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)，惡性程度最高的惡性腫瘤患者的5年生存率極低，且中位生存期僅為12～15個(gè)月，預(yù)后極差，其主要的治療方法為手術(shù)切除及放化療，但是外科手術(shù)難以完全切除腫瘤，并且手術(shù)后放化療效果不佳，腫瘤復(fù)發(fā)嚴(yán)重[1-2]。因此，深入探討腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制從而尋找有效的治療方法至關(guān)重要?？寡苄律桥R床上腫瘤治療的常用策略[3]，但是腦膠質(zhì)瘤微環(huán)境中含有大量的異質(zhì)性新生血管，臨床上針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的藥物，如貝伐單抗等對(duì)于其治療效果并不佳[4]。外泌體是一類(lèi)由大多數(shù)活細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡，腫瘤細(xì)胞可分泌外泌體調(diào)控腫瘤微環(huán)境[5-6]，而腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞外泌體是否能夠作用于VEGF而調(diào)控腫瘤血管新生尚無(wú)明確研究。因此，本研究探討了腦膠質(zhì)瘤外泌體對(duì)血管新生的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U373、U87，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC，人腦膠質(zhì)細(xì)胞HEB(中科院上海生化細(xì)胞所)，Transwell小室、Matergial膠(福麥斯生物技術(shù)有限公司)，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物技術(shù)有限公司)，Bax、Caspase3、Caspase9、VEGF、VEGFR2、p-AKT、AKT、GAPDH一抗、山羊抗兔二抗(沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物技術(shù)有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取液氮保存的HEB、U373、U87細(xì)胞于37℃水浴鍋中迅速解凍，離心后重懸于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清及1%的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的DMEM高糖培養(yǎng)基中；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合率達(dá)80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3 外泌體的提取與鑒定 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEB、U373、U87細(xì)胞培養(yǎng)基更換為10%的無(wú)外泌體胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，使用差速離心法提取細(xì)胞培養(yǎng)上清中外泌體，具體步驟：將上清液3000×g，4℃離心15 min去除死細(xì)胞；然后將上清液6000×g離心40 min，去除細(xì)胞碎片；10000×g離心1 h，取上清；100000×g離心1 h，收集沉淀即為外泌體，用400 μL PBS重懸外泌體，并放在-80℃保存。使用透射電鏡拍照觀察外泌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)：將透射電鏡所用的銅網(wǎng)平放到稱(chēng)量紙上，滴加20 μL外泌體溶液，紅外燈下烘烤10 min；烘干后再滴加2滴磷鎢酸，繼續(xù)烘烤10 min，用濾紙吸走多余液體，透射電鏡下觀察外泌體結(jié)構(gòu)并拍照。Western blot鑒定外泌體標(biāo)志蛋白的表達(dá)，具體步驟：取200 μL外泌體加入50 μL的RIPA蛋白裂解液，于冰上裂解30 min，12000×r，離心15 min后，取上清，即為外泌體總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，取外泌體蛋白裂解液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜，封閉后CD9、CD63、TSG101一抗孵育過(guò)夜，然后二抗孵育，洗膜后，曝光成像。

1.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 用不含胎牛血清及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的DMEM培養(yǎng)基重懸HUVEC細(xì)胞，調(diào)整HUVEC細(xì)胞密度至5×104個(gè)/mL，并取200 μL上述HUVEC細(xì)胞接種至Transwell小室中，每個(gè)小室加入外泌體并使其終濃度為0.2 μg/μL，每組3個(gè)復(fù)孔，小室放置于含有600 μL完全培養(yǎng)基的24孔板，使其底部完全浸入培養(yǎng)基中，并將24孔板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出小室用PBS清洗3次，小室倒扣，底部用甲醇固定30min，晾干后用結(jié)晶紫對(duì)小室底部染色10 min，清洗并晾干后，在顯微鏡下觀察拍照。

1.5 細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至3×104個(gè)/mL，于96孔板中每孔加入100 μL上述細(xì)胞稀釋液，并且設(shè)置24、48、72 h時(shí)間梯度，按相同的方法平行接種3塊相同的96孔板；96孔板細(xì)胞完全貼壁后，每孔加入外泌體并使其終濃度為0.2 μg/μL，然后將3塊96孔板放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48、72 h后取出對(duì)應(yīng)的96孔板，避光向每孔中加入10 μL的CCK-8試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，然后使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光度，以空白組吸光度為背景值。

1.6 小管形成實(shí)驗(yàn) 4℃條件下融化Matrigel膠，96孔板中每孔加入50 μL Matrigel膠，輕輕搖晃96孔板，使Matrigel膠均勻覆蓋于96孔板底部，37℃培養(yǎng)箱中放置30 min，使Matrigel膠充分凝固。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至3×105個(gè)/mL，于96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞稀釋液，然后每孔加入外泌體并使其終濃度為0.2 μg/μL，每組3個(gè)復(fù)孔，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，然后在顯微鏡下觀察并拍照，使用Image J軟件計(jì)算小管形成。

1.7 細(xì)胞凋亡 取3×105個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入外泌體并使其終濃度為0.2 μg/μL，每組3個(gè)復(fù)孔，共孵育48 h后進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，每孔取5×105個(gè)HUVEC細(xì)胞于離心管中，用500 μL的Binding Buffer重懸細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，而后添加5 μL的Annexin V-FLTC和5 μL的PI染料，混勻后室溫避光孵育15 min，并設(shè)置Annexin V-FLTC和PI單陽(yáng)性管用于調(diào)熒光補(bǔ)償，空白管用于調(diào)電壓。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)上述各樣品的熒光值，使用FlowJo v5.573軟件分析細(xì)胞凋亡數(shù)。

1.8 Western blot檢測(cè)蛋白水平 取3×105個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入外泌體并使其終濃度為0.2 μg/μL，每組3個(gè)復(fù)孔，共孵育48 h后，每孔細(xì)胞加入120 μL的RIPA蛋白裂解液和1.2 μL的PMSF蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min后12000×r，4℃離心10 min，取上清，即為細(xì)胞總蛋白。BCA蛋白定量后蛋白沸水浴加熱變性，然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂牛奶對(duì)PVDF膜封閉2 h，然后以1：1000比例稀釋后的VEGF、GAPDH一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說(shuō)明書(shū)配置發(fā)光液，并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應(yīng)30 s，曝光并拍照，用Image J軟件對(duì)曝光結(jié)果進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 外泌體鑒定結(jié)果 透射電鏡觀察外泌體結(jié)構(gòu)顯示，外泌體具有雙層膜結(jié)構(gòu)，形態(tài)呈“杯托”狀，粒徑在50～100 nm，符合外泌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖1；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，提取的外泌體表達(dá)標(biāo)志蛋白CD63、CD9、Alix，見(jiàn)圖2。

圖1 透射電鏡觀察外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu)Figure 1 Observation of the morphology and structure of exosomes by transmission electron microscope

2.2 腦膠質(zhì)瘤外泌體促進(jìn)HUVEC遷移能力 細(xì)胞遷移檢測(cè)結(jié)果顯示，HEB-exo組HUVEC細(xì)胞遷移數(shù)目與PBS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；U373-exo和U87-exo組HUVEC細(xì)胞遷移數(shù)目顯著高于PBS組(P<0.05)，見(jiàn)圖3。說(shuō)明腦膠質(zhì)瘤外泌體能夠顯著促進(jìn)HUVEC細(xì)胞遷移能力。

2.3 腦膠質(zhì)瘤外泌體促進(jìn)HUVEC細(xì)胞增殖能力 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力結(jié)果顯示，相比于PBS組，HEB-exo組HUVEC細(xì)胞增殖能力無(wú)顯著變化(P>0.05)；而U373-exo和U87-exo組HUVEC細(xì)胞24、48、72 h增殖能力顯著高于PBS組(均P<0.05)，見(jiàn)圖4。這提示腦膠質(zhì)瘤外泌體能夠顯著促進(jìn)HUVEC細(xì)胞增殖能力，從而促進(jìn)血管新生。

圖4 CCK-8法檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤外泌體對(duì)HUVEC增殖能力的影響Figure 4 CCK-8 method to detect the effect of glioma exosomes on the proliferation of HUVEC注：與PBS組相比，①P<0.05，②P<0.01，③P<0.001

2.4 腦膠質(zhì)瘤外泌體促進(jìn)HUVEC細(xì)胞小管形成 小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HEB-exo組HUVEC小管形成與PBS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而U373和U87細(xì)胞所分泌的外泌體能夠顯著促進(jìn)HUVEC細(xì)胞體外小管形成(P<0.001)，見(jiàn)圖5。這說(shuō)明腦膠質(zhì)瘤外泌體能夠顯著促進(jìn)體外小管形成。

圖5 小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤外泌體對(duì)小管形成的影響Figure 5 Tubule formation experiment to detect the effect of glioma exosomes on tubule formation注：與PBS組相比，①P<0.001

2.5 腦膠質(zhì)瘤外泌體抑制HUVEC細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，HEB-exo組HUVEC細(xì)胞凋亡率與PBS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；U373-exo和U87-exo組HUVEC細(xì)胞凋亡率均顯著低于PBS組(均P<0.01)，見(jiàn)圖6。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，U373-exo和U87-exo組HUVEC細(xì)胞促凋亡蛋白Bax、Caspase3、Caspase9表達(dá)水平均顯著低于PBS組(P<0.001)，見(jiàn)圖7。說(shuō)明腦膠質(zhì)瘤外泌體能夠顯著抑制抑制促凋亡蛋白的表達(dá)而抑制HUVEC細(xì)胞凋亡。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤外泌體對(duì)HUVEC凋亡的影響Figure 6 Flow cytometry to detect the effect of glioma exosomes on HUVEC apoptosis注：與PBS組相比，①P<0.01，②P<0.001

圖7 Western blot檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤外泌體對(duì)凋亡蛋白表達(dá)的影響Figure 7 Western blot to detect the effect of brain glioma exosomes on the expression of apoptotic proteins注：與PBS組相比，①P<0.001

2.6 腦膠質(zhì)瘤外泌體對(duì)VEGF信號(hào)通路的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，相比于PBS組，HEB-exo組HUVEC細(xì)胞VEGF、VEGFR2表達(dá)水平及AKT磷酸化水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而U373-exo和U87-exo組HUVEC細(xì)胞VEGF、VEGFR2表達(dá)水平顯著高于PBS組(P<0.001)，AKT磷酸化水平亦顯著高于PBS組(P<0.001)，見(jiàn)圖8。說(shuō)明腦膠質(zhì)瘤外泌體能夠促進(jìn)VEGF、VEGFR2的表達(dá)進(jìn)而激活促血管生成的AKT信號(hào)通路。

圖8 Western blot檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤外泌體對(duì)VEGF信號(hào)通路的影響Figure 8 Western blot to detect the effect of glioma exosomes on the VEGF signaling pathway注：與PBS組相比，①P<0.001

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是一般來(lái)自于原始胚胎神經(jīng)細(xì)胞或者為其他神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在顱內(nèi)的原發(fā)腫瘤，臨床上腦膠質(zhì)瘤的主要治療手段有手術(shù)治療及放、化療等[7-8]，但由于腦膠質(zhì)瘤血管密集，血運(yùn)豐富，腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)性極高，不能準(zhǔn)確區(qū)分腫瘤組織的邊界，為外科手術(shù)的治療帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)，所以探究腦膠質(zhì)瘤血管新生的機(jī)制，對(duì)于提高腦膠質(zhì)瘤的治療效果至關(guān)重要[9-10]。腫瘤微環(huán)境中的血管新生不僅可以為腫瘤的生長(zhǎng)提供給氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還參與腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移以及腫瘤的復(fù)發(fā)[11]。血管新生在正常生理?xiàng)l件下受到嚴(yán)格的調(diào)控，只有在病理?xiàng)l件或者特殊的情況下才能夠被激活，并且血管過(guò)度的生成以及缺陷都會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生、發(fā)展。正常生理?xiàng)l件下的大部分血管呈現(xiàn)發(fā)育成熟靜止?fàn)顟B(tài)，但是血管內(nèi)皮細(xì)胞仍具有對(duì)生理刺激產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)而快速增殖和遷移的能力，在接受外界信號(hào)刺激后，血管內(nèi)皮細(xì)胞啟動(dòng)增殖遷移的應(yīng)答反應(yīng)，開(kāi)始血管新生的生理過(guò)程[12-14]。外泌體是一種由細(xì)胞分泌的粒徑在30～100 nm的納米級(jí)囊泡，可包裹RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)，能夠與靶細(xì)胞受體結(jié)合或水平傳遞生物活性物質(zhì)而發(fā)揮生物學(xué)功能，包括血管新生、免疫逃逸、腫瘤耐藥等[15-18]。

已有研究[19-21]表明，腫瘤外泌體具有調(diào)控血管新生的功能，例如卵巢癌外泌體miR-205能夠誘導(dǎo)血管新生而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，胃癌外泌體miR-130a可靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞C-MYB而誘導(dǎo)血管新生，宮頸鱗狀細(xì)胞癌外泌體miR-221-3p可靶向THBS2而誘導(dǎo)血管新生。本研究腦膠質(zhì)細(xì)胞U373和U87細(xì)胞所分泌的外泌體相比于正常腦膠質(zhì)細(xì)胞外泌體能夠顯著促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移以及體外小管形成能力、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡能力，并且下調(diào)促凋亡蛋白Bax、Caspase3、Caspase9表達(dá)水平。說(shuō)明腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞外泌體能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞血管形成的能力。

血管新生受多種細(xì)胞因子的調(diào)控，如腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)、VEGF、血管緊張素Ⅰ/Ⅱ(Angiotensin，AngⅠ/Ⅱ)等[22-24]。其中，VEGF是屬于血小板源性生長(zhǎng)因子家族超家族之一，是促血管活性因子中活性最強(qiáng)、特異性最高的血管生成因子，VEGF與其受體特異性結(jié)合后能夠激活酪氨酸激酶信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，誘導(dǎo)血管新生，并且增加血管的通透性，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[25]。腦膠質(zhì)細(xì)胞U373和U87細(xì)胞外泌體可促進(jìn)促血管生成因子VEGF及其受體VEGFR2的表達(dá)，促血管新生的PI3K/AKT信號(hào)通路中AKT的磷酸化水平顯著增加，PI3K/AKT信號(hào)通路被激活。PI3K/AKT信號(hào)通路是調(diào)控血管新生的重要通路，激活PI3K/AKT信號(hào)通路可誘導(dǎo)膀胱癌、皮膚癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的血管新生[26-28]。本研究發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤外泌體可調(diào)控VEGF表達(dá)和PI3K/AKT信號(hào)通路而促進(jìn)血管新生。

4 結(jié)論

腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U373和U87外泌體能夠促進(jìn)體外血管新生，其機(jī)制為上調(diào)VEGF的表達(dá)，激活PI3K/AKT信號(hào)通路。