阿布利克木·依明 艾力根·阿不都熱依木 唐亮 巴圖 盧旦丹

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 1.耳鼻喉診療中心；2.病理科，新疆 烏魯木齊 830001)

下咽癌是最常見(jiàn)的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌之一，是一種相對(duì)罕見(jiàn)的異質(zhì)性惡性腫瘤，預(yù)后較差[1-3]。器官-保護(hù)化療應(yīng)用于早期階段的下咽癌患者，手術(shù)切除和重建主要針對(duì)于下咽癌晚期和復(fù)發(fā)腫瘤患者[4]。盡管最近手術(shù)和化療等治療方式不斷進(jìn)步，但下咽癌的患者的5年生存率并無(wú)明顯改善[5]。之前的研究[6-10]表明，小分子核糖核酸(microRNA，miRNA)是一大群短非編碼RNA，在包括下咽癌在內(nèi)的廣泛的人類腫瘤中起著重要作用。近些年研究發(fā)現(xiàn)很多異常表達(dá)的miRNA與下咽癌發(fā)生有關(guān)：如Xu等[11]研究表明miRNA 4451的過(guò)表達(dá)與下咽癌術(shù)后放療患者的生存期較差相關(guān)；Kikkawa等[12]發(fā)現(xiàn)miRNA-504通過(guò)靶向CDK6抑制下咽鱗狀細(xì)胞癌的癌細(xì)胞增殖；另有研究[13]發(fā)現(xiàn)miR98/PTEN/AKT通路通過(guò)MTDH抑制下咽癌細(xì)胞增殖和惡性進(jìn)展。研究[14]表明miR-98與肝癌增殖、膠質(zhì)瘤侵襲和肺癌發(fā)展等有關(guān)。但是有關(guān)miR-98調(diào)控下咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制仍不清楚。因此，本研究主要揭示miR-98調(diào)控下咽癌Fadu細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為進(jìn)一步探討下咽癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 35例下咽癌組織及其28例癌旁正常組織來(lái)自于我院2016年10月～2021年1月臨床確診的下咽癌患者。所有患者術(shù)前均未接受放、化療處理，均經(jīng)病理證實(shí)，于-80℃保存?zhèn)溆谩２杉瘶?biāo)本及其實(shí)驗(yàn)過(guò)程均經(jīng)過(guò)患者和家屬的同意，并獲得了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。人下咽癌細(xì)胞(Fadu細(xì)胞)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，DMEM(Dulbecco′s-modified Eagle′s medium)培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司，E-cadherin(ab212059，1:1000)、N-cadherin(ab76011，1:5000)、p-JAK(ab138005，1:1000)和p-STAT3(ab267373、1:1000)抗體購(gòu)自Abcam，miR-98模擬物和抑制劑來(lái)自GenePharma公司。

1.2 方法

1.2.1 Fadu細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的Fadu細(xì)胞離心后，重懸細(xì)胞并置于提前加入10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，懸浮的細(xì)胞在37℃、飽和濕度和5% CO2培養(yǎng)箱環(huán)境中沉淀并貼壁生長(zhǎng)。

1.2.2 Fadu細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)皿中處于對(duì)數(shù)期的Fadu細(xì)胞稀釋并鋪于12孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前替換培養(yǎng)液為不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，細(xì)胞融合在75%左右，細(xì)胞分為①inhibitor NC組、miR-98 inhibitor組、mimics NC組、miR-98 mimics組。②mimics NC+EZH2 wt組、miR-98 mimics+EZH2 wt組、mimics NC+EZH2 mut組、miR-98 mimics+EZH2 mut組。③siRNA NC組、EZH2 siRNA組、pcDNA-3.1(+)組、pcDNA-EZH2組、pcDNA-EZH2+AG490組。④mimics NC+pcDNA-3.1(+)組、pcDNA-EZH2+mimics NC組、miR-98 mimics+pcDNA-3.1(+)組、pcDNA-EZH2+miR-98 mimics組。通過(guò)Turbofect將實(shí)現(xiàn)所需的重組質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至12孔板中的細(xì)胞內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)箱孵育至48 h，細(xì)胞樣品采集后立即實(shí)驗(yàn)分析。

1.2.3 細(xì)胞增殖測(cè)定 將培養(yǎng)皿中用Turbofect轉(zhuǎn)染成功且狀態(tài)良好的Fadu細(xì)胞稀釋后接種在96孔板，細(xì)胞在適宜生長(zhǎng)條件下孵育48 h，每孔用100 μL PBS清洗細(xì)胞，再緩慢將10 μL CCK-8液體加至每孔細(xì)胞，3 h后取出培養(yǎng)板分析450 nm處細(xì)胞的吸光值。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè) 我們先利用TargetScan預(yù)測(cè)分析miR-98的作用靶基因，選取EZH2后并通過(guò)構(gòu)建EZH2 wt和EZH2 mut載體進(jìn)行驗(yàn)證，取EZH2 wt、EZH2 mut質(zhì)粒再分別與miR-98mimics、mimics NC共同按照說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染到12孔板中融合度為70%～75%的Fadu細(xì)胞，48 h后進(jìn)一步利用雙熒光素酶報(bào)告基因盒檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 取Matrigel 100 μL基質(zhì)加入Transwell上室并使其干燥，將1 mL胰酶(每孔細(xì)胞)加入用Turbofect試劑轉(zhuǎn)染48 h的Fadu細(xì)胞中，消化適合后用新鮮培養(yǎng)基重新細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液，取1×105個(gè)細(xì)胞懸液加入上室，下室用500 μL 含10%FBS DMEM培養(yǎng)基覆蓋，培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下隨機(jī)選取不同視野觀察并計(jì)數(shù)。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平 細(xì)胞總RNA的提取利用Trizol法按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，提取的RNA測(cè)定濃度和純度，參照說(shuō)明書(shū)完成反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)得到的cDNA稀釋10倍并以其為模板進(jìn)行RT-qPCR，設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，反應(yīng)完成后使用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)的表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.7 Western blot檢測(cè)蛋白水平 細(xì)胞蛋白樣品中加入裂解液提取總蛋白，檢測(cè)蛋白濃度后每個(gè)泳道加入定量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，按大小不同分離后的蛋白濕轉(zhuǎn)到PVDF膜，再置于5%的脫脂奶粉配置的封閉液中過(guò)夜孵育，PVDF膜置于一抗稀釋液中[E-cadherin(1:1000)、N-cadherin(1:5000)、p-JAK(1:1000)和p-STAT3(1:1000)]過(guò)夜反應(yīng)，TBST洗PVDF膜5次，加入二抗稀釋液在室溫反應(yīng)2 h，TBST洗PVDF膜5次，PVDF膜上均勻滴加ECL試劑再進(jìn)行蛋白曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-98 inhibitor促進(jìn)Fadu細(xì)胞增殖、侵襲和EMT miR-98在下咽癌組織中表達(dá)量顯著低于癌旁組織(P<0.01)，見(jiàn)圖1A 。miR-98抑制劑下調(diào)miR-98表達(dá)使細(xì)胞增殖能力顯著上升(P<0.05)，見(jiàn)圖1B。與inhibitor NC組相比，miR-98 inhibitor組Fadu細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增加(P<0.01)，見(jiàn)圖1C、D。miR-98抑制劑下調(diào)miR-98表達(dá)使N-cadherin/GAPDH比值上升(P<0.01)，E-cadherin/GAPDH比值下降(P<0.01)，見(jiàn)圖1E、F。說(shuō)明miR-98 inhibitor促進(jìn)了Fadu細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT。

圖1 miR-98抑制劑下調(diào)miR-98表達(dá)后分析Fadu細(xì)胞增殖、侵襲和EMT能力Figure 1 Analysis of proliferation，invasion and EMT ability of Fadu cells after down-regulation of miR-98 expression by miR-98 inhibitor注：A.miR-98在癌旁組織和下咽癌組織中的mRNA表達(dá)；B.miR-98抑制劑下調(diào)miR-98表達(dá)后Fadu細(xì)胞增殖活力；C.miR-98抑制劑下調(diào)miR-98表達(dá)后Fadu細(xì)胞侵襲情況；D.Fadu細(xì)胞侵襲數(shù)目；E.miR-98抑制劑下調(diào)miR-98表達(dá)后Fadu細(xì)胞EMT情況；F.下調(diào)miR-98后E-cadherin與N-cadherin相對(duì)表達(dá)。與癌旁組織比較，①P<0.05；與inhibitor NC組比較，②P<0.05

2.2 miR-98與EZH2的靶向及其負(fù)調(diào)控關(guān)系 TargetScan預(yù)測(cè)miR-98和EZH2之間的結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖2A。與mimics NC+EZH2 wt組相比，miR-98 mimics+EZH2 wt組熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，與mimics NC+EZH2 mut組相比，miR-98 mimics+EZH2 mut組熒光素酶活性無(wú)變化(P>0.05)，見(jiàn)圖2B。miR-98模擬物上調(diào)miR-98表達(dá)顯著降低EZH2 mRNA水平(P<0.01)；miR-98 抑制劑下調(diào)miR-98表達(dá)顯著提升EZH2 mRNA水平(P<0.01)，見(jiàn)圖2C。說(shuō)明miR-98靶向EZH2后進(jìn)一步負(fù)調(diào)控EZH2在Fadu細(xì)胞中的表達(dá)。

圖2 miR-98與EZH2在Fadu細(xì)胞中的靶向及負(fù)調(diào)控關(guān)系Figure 2 Targeting and negative regulation of miR-98 and EZH2 in Fadu cells注：A.TargetScan顯示miR-98與EZH2的潛在結(jié)合位點(diǎn)；B.分析雙熒光素酶報(bào)告基因活性；C.miR-98模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)入Fadu細(xì)胞后檢測(cè)EZH2表達(dá)。與EZH2+mimics組相比，①P<0.05；與inhibtor NC組比較，②P<0.05；與mimics NC組比較，③P<0.05

2.3 EZH2 siRNA抑制Fadu細(xì)胞增殖、侵襲和EMT EZH2在下咽癌組織中mRNA表達(dá)量顯著高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖3A。siRNA技術(shù)顯著降低EZH2表達(dá)使細(xì)胞增殖活力明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)圖3B。siRNA技術(shù)顯著降低EZH2表達(dá)進(jìn)一步減少了Fadu細(xì)胞侵襲數(shù)目(P<0.01)，見(jiàn)圖3C、D。siRNA技術(shù)顯著降低EZH2表達(dá)提高了E-cadherin/GAPDH比值(P<0.01)，降低N-cadherin/GAPDH比值(P<0.01)，見(jiàn)圖3E、F。表明EZH2 siRNA抑抑制了Fadu細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT。

圖3 siRNA技術(shù)顯著降低EZH2表達(dá)抑制Fadu細(xì)胞增殖、侵襲和EMTFigure 3 SiRNA technology significantly reduced EZH2 expression and inhibited proliferation，invasion and EMT of Fadu cells注：A.分析EZH2在癌旁組織和下咽癌組織中的mRNA表達(dá)；B.EZH2 siRNA轉(zhuǎn)染后Fadu細(xì)胞中EZH2的mRNA水平；C.siRNA技術(shù)顯著降低EZH2表達(dá)后檢測(cè)Fadu細(xì)胞活力；D.siRNA技術(shù)顯著降低EZH2表達(dá)后檢測(cè)Fadu細(xì)胞侵襲；E.Fadu細(xì)胞侵襲數(shù)目；F.siRNA技術(shù)顯著降低EZH2表達(dá)后檢測(cè)Fadu細(xì)胞EMT；G.EZH2 siRNA轉(zhuǎn)染后Fadu細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin相對(duì)表達(dá)。與癌旁組織相比，①P<0.05；與siRNA NC組比較，②P<0.05

2.4 miR-98 mimics通過(guò)EZH2抑制Fadu細(xì)胞增殖、侵襲和EMT 與mimics NC組相比，miR-98 mimics組的miR-98表達(dá)量明顯升高(P<0.01)，與pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-EZH2組的EZH2表達(dá)量明顯升高(P<0.01)，見(jiàn)圖4A。與mimics NC+pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-EZH2+mimics NC組的細(xì)胞增殖活力明顯升高(P<0.05)，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增加(P<0.01)，N-cadherin/GAPDH比值明顯著上調(diào)(P<0.01)，E-cadherin/GAPDH比值明顯降低(P<0.01)；miR-98 mimics+pcDNA-3.1(+)組的細(xì)胞增殖活力明顯降低(P<0.01)，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少(P<0.01)，E-cadherin/GAPDH比值明顯上升(P<0.01)，N-cadherin/GAPDH比值降低(P<0.01)；與miR-98 mimics+pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-EZH2+miR-98 mimics組的細(xì)胞增殖活力明顯升高(P<0.01)，細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增加(P<0.01)，N-cadherin/GAPDH比值上調(diào)(P<0.01)，E-cadherin/GAPDH比值下降(P<0.01)，見(jiàn)圖4B～F。表明miR-98 mimics通過(guò)EZH2抑制了Fadu細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT。

圖4 miR-98mimics通過(guò)EZH2抑制Fadu細(xì)胞增殖、侵襲和EMTFigure 4 miR-98mimics inhibited proliferation，invasion and EMT of Fadu cells by EZH2注：A.miR-98 mimics、pcDNA-EZH2轉(zhuǎn)染Fadu細(xì)胞后分析細(xì)胞活力；B.miR-98 mimics、pcDNA-EZH2轉(zhuǎn)染Fadu細(xì)胞后分析細(xì)胞侵襲；C.Fadu細(xì)胞侵襲數(shù)目；D.miR-98 mimics、pcDNA-EZH2轉(zhuǎn)染Fadu細(xì)胞后分析細(xì)胞EMT；E.E-cadherin/GAPDH及其N-cadherin/GAPDH比值。與mimics NC+pcDNA-3.1(+)組相比，①P<0.05；與miR-98 mimics+pcDNA-3.1(+)組相比，②P<0.05

2.5 pcDNA-EZH2通過(guò)JAK/STAT3通路促進(jìn)Fadu細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT 過(guò)表達(dá)EZH2組顯著提高Fadu細(xì)胞內(nèi)p-JAK/JAK和p-STAT3/STAT3比值(P<0.01)，下調(diào)EZH2顯著降低細(xì)胞內(nèi)p-JAK/JAK和p-STAT3/STAT3比值(P<0.01)。表明過(guò)表達(dá)EZH2能夠激活Fadu細(xì)胞內(nèi)JAK/STAT3信號(hào)通路，見(jiàn)圖5A、B。AG490作用細(xì)胞后JAK磷酸化水平明顯低于空白組(P<0.01)，見(jiàn)圖5C。上調(diào)EZH2表達(dá)促使細(xì)胞增殖活力提升(P<0.05)，明顯增加細(xì)胞侵襲數(shù)目(P<0.01)，顯著降低E-cadherin/GAPDH比值(P<0.01)，提高N-cadherin/GAPDH比值(P<0.01)；與pcDNA-EZH2組相比，pcDNA-EZH2+AG490降低細(xì)胞增殖活力(P<0.05)和細(xì)胞侵襲數(shù)目(P<0.01)，提升了E-cadherin表達(dá)(P<0.01)，并降低了N-cadherin表達(dá)(P<0.01)，見(jiàn)圖5D～H。表明pcDNA-EZH2通過(guò)JAK/STAT3通路促進(jìn)Fadu細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT。

圖5 pcDNA-EZH2通過(guò)JAK/STAT3通路調(diào)控Fadu細(xì)胞的增殖和EMTFigure 5 pcDNA-EZH2 regulated proliferation and EMT of Fadu cells through the JAK/STAT3 pathway注：A.過(guò)表達(dá)或下調(diào)EZH2在Fadu細(xì)胞中的表達(dá)后分析JAK/STAT3通路表達(dá)；B.p-JAK/JAK和p-STAT3/STAT3比值；C.AG490作用細(xì)胞后檢測(cè)JAK磷酸水平；D.pcDNA-EZH2、AG490作用Fadu細(xì)胞后分析細(xì)胞增殖能力；E.pcDNA-EZH2、AG490作用Fadu細(xì)胞后分析細(xì)胞侵襲能力；F.Fadu細(xì)胞侵襲數(shù)目；G.pcDNA-EZH2、AG490作用Fadu細(xì)胞后分析細(xì)胞EMT能力；H.E-cadherin、N-cadherin與GAPDH的比值。與pCDNA-3.1(+)組相比，①P<0.05；與siRNA NC組相比，②P<0.05；與pcDNA-EZH2組相比，③P<0.05

3 討論

盡管許多下咽癌患者在最終的放化療后進(jìn)行了手術(shù)切除，但由于圍手術(shù)期并發(fā)癥，其預(yù)后往往不令人滿意。因此，研究其他可行的治療策略來(lái)預(yù)防下咽癌是至關(guān)重要的。microRNAs是一類非編碼的、高度保守的單鏈RNA[15-17]，通過(guò)作為腫瘤抑制基因或癌基因來(lái)解除基因表達(dá)調(diào)控和改變?nèi)祟惏┌Y的轉(zhuǎn)錄后基因沉默[18-19]。miRNA-98在腫瘤生物學(xué)的多個(gè)方面發(fā)揮重要作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如，Yang等[20]研究發(fā)現(xiàn)miR-98通過(guò)靶向PAK1抑制非小細(xì)胞癌肺癌的細(xì)胞增殖和侵襲。Fan等[21]認(rèn)為過(guò)表達(dá)miR-98可通過(guò)下調(diào)IKKe抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的細(xì)胞侵襲。Siragam等[22]發(fā)現(xiàn)miR-98通過(guò)靶向激活素受體樣激酶-4和基質(zhì)金屬蛋白酶-11抑制腫瘤血管生成和侵襲。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-98在下咽癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)顯著降低。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)miR-98可促進(jìn)下咽癌細(xì)胞增殖、侵襲及其EMT進(jìn)程，提示miR-98在下咽癌進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮了重要的生物學(xué)作用。

Zeste基因增強(qiáng)子同源物2(Enhancer of zeste homolog 2，EZH2)是Polycomb group (PcG)蛋白家族的成員。EZH2基因位于染色體7q35上，包含20個(gè)外顯子和19個(gè)內(nèi)含子。EZH2是PRC2的催化亞基，包含一個(gè)SET結(jié)構(gòu)域，通過(guò)影響組蛋白和DNA甲基化在表觀遺傳水平上修飾轉(zhuǎn)錄[23-24]。有證據(jù)表明EZH2作為致癌基因參與了癌變。例如，Huang等[25]報(bào)道EZH2在喉鱗癌中過(guò)表達(dá)，增強(qiáng)了AMC-HN-8細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性。Ko等[26]研究表明，GSK3b失活可促進(jìn)EZH2的致癌功能，并增強(qiáng)人類乳腺癌中H3K27的甲基化。Zhu等[27]發(fā)現(xiàn)miR-138通過(guò)靶向EZH2作為腫瘤抑制因子，增強(qiáng)了順鉑誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。本研究通過(guò)TargetScan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-98直接靶向EZH2且負(fù)調(diào)控其表達(dá)。本研究通過(guò)下調(diào)EZH2表達(dá)進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，結(jié)果表明，下調(diào)EZH2抑制了下咽癌細(xì)胞增殖、侵襲及其EMT進(jìn)程。越來(lái)越多的研究表明JAK/STAT3通路參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[28]。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)EZH2可以挽救miR-98模擬物產(chǎn)生的表型，上調(diào)EZH2激活了Fadu細(xì)胞內(nèi)JAK/STAT3通路。而我們?cè)诤罄m(xù)研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)EZH2通過(guò)JAK/STAT3通路在Fadu細(xì)胞增殖、侵襲和EMT過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

本研究表明miR-98在下咽癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用，而EZH2是miR-98的作用靶點(diǎn)。進(jìn)一步研究表明，miRNA-98靶向EZH2激活JAK/STAT3通路調(diào)控下咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。因此，這些研究結(jié)果表明miR-98可以作為下咽癌治療的靶點(diǎn)。