王 正 張倩月 宋懷東

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院分子診斷與內(nèi)分泌科 上海 200011）

新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）是由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒-2（SARS-CoV-2）感染所引起的一系列疾病，患者表現(xiàn)從無明顯癥狀到全身器官衰竭，甚至死亡［1］。盡管和SARS-CoV一樣，SARS-CoV-2進(jìn)入靶細(xì)胞的受體為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin I converting enzyme 2，ACE2）［2-3］，但這兩種病毒的增殖模式卻有所不同。SARS-CoV-2在癥狀發(fā)生前，即可在呼吸道中被檢測到［4-6］，而且在癥狀發(fā)作后，病毒負(fù)荷很快達(dá)到峰值［7-9］。這些特點(diǎn)導(dǎo)致SARS-CoV-2的傳染性極高，由此引發(fā)了全球的COVID-19大流行。SARS-CoV-2感染和機(jī)體的免疫反應(yīng)均可以直接或間接破壞患者的呼吸道細(xì)胞［2，10］，大多數(shù)患者表現(xiàn)為輕度至中度的癥狀，進(jìn)展為重度肺炎的概率高達(dá)15%，并有約5%的患者最終發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征伴有或不伴有多器官衰竭［2］。老年和免疫功能低下的COVID-19患者病死率較高［11-14］。

由于目前尚無針對SARS-CoV-2的有效藥物，因此迫切需要了解疾病期間宿主的免疫反應(yīng)，以便篩選預(yù)后和診斷的指標(biāo)，為重癥患者制定適當(dāng)?shù)闹委煷胧┨峁┲笇?dǎo)。

急性病毒感染和宿主的免疫反應(yīng)在體內(nèi)相互作用，是影響疾病嚴(yán)重程度以及患者臨床預(yù)后的主要因素［10］，因此COVID-19的免疫病理學(xué)受到了廣泛關(guān)注。目前，針對非重癥COVID-19患者的免疫反應(yīng)的研究顯示，急性SARS-CoV-2感染可引起強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，但是尚不清楚先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)是如何導(dǎo)致肺部損傷的［15］；而重癥患者則表現(xiàn)出明顯的淋巴細(xì)胞減少和血清促炎因子升高［16-17］。有報道稱，在一個死亡病例的雙肺中存在明顯的間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤，并在該病例外周血中發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞過度活化［18］。此外，在重癥COVID-19患者的支氣管肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)炎癥性FCN1+巨噬細(xì)胞取代了FABP4+巨噬細(xì)胞，而在非重癥SARS-CoV-2感染患者支氣管肺泡灌洗液中觀察到大量擴(kuò)增的組織駐留性CD8+T細(xì)胞［19］。這些發(fā)現(xiàn)部分揭示了COVID-19發(fā)生發(fā)展的免疫病理學(xué)機(jī)制，但對于不同病情下的抗病毒或致病性免疫反應(yīng)的理解仍不夠充分。

在這項研究中，我們通過整合重癥、輕癥、恢復(fù)早期以及恢復(fù)晚期的COVID-19患者外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（single-cell RNA sequence，scRNAseq）數(shù)據(jù)［20-21］并進(jìn)行分析，進(jìn)而構(gòu)建出輕重癥及轉(zhuǎn)歸階段的COVID-19患者外周血免疫細(xì)胞的高分辨率轉(zhuǎn)錄組圖譜，從而研究SARS-CoV-2感染不同時期的轉(zhuǎn)錄變化，以便更好地了解該疾病進(jìn)展和恢復(fù)過程中人體的免疫反應(yīng)改變。

材料和方法

數(shù)據(jù)集從ENA（European Nucleotide Archive）數(shù)據(jù)庫中獲得已公開的來自COVID-19重癥患者、輕癥患者和健康對照PBMCs的單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)（https：//www.ebi.ac.uk/ena/browser），登錄號為SRP259912［20］；已公開的恢復(fù)期患者數(shù)據(jù)來自GSA（Genome Sequence Archive）數(shù)據(jù) 庫（https：//bigd.big.ac.cn/gsa/browse），登 錄 號 為CRA 002497［21］。數(shù)據(jù)格式均為fastq。COVID-19患者SARS-CoV-2核酸檢測均為陽性。其中，正在使用機(jī)械通氣或體外膜氧合等呼吸支持療法的COVID-19患者為重癥患者，不需要呼吸支持療法者為輕度患者。SARSCoV-2核酸檢測轉(zhuǎn)陰者為恢復(fù)期患者，早期恢復(fù)患者核酸檢測轉(zhuǎn)陰天數(shù)＜7天，晚期恢復(fù)患者核酸檢測轉(zhuǎn)陰＞14天。

scRNA-seq數(shù)據(jù)處理通過CellRanger v.4.0.0（https：//support.10xgenomics.com/）軟 件，使 用GRCh38版本的人類參考基因組，為每個樣本生成初始基因表達(dá)矩陣。通過R軟件v.3.6.4（http：//satijalab.org/seurat/）和Seurat包v.3.1.0［22］分析初始的基因表達(dá)矩陣。首先，選擇表達(dá)基因的細(xì)胞數(shù)目（min.cells）＞10的基因，并選擇表達(dá)基因數(shù)（min.features）＞200的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步分析。如果細(xì)胞符合以下條件，則將其刪除：（1）表達(dá)基因數(shù)＞4 500個；（2）表達(dá)基因數(shù)＜200個；（3）來自線粒體基因組的UMI＞15%。去除低質(zhì)量細(xì)胞后，使用Seurat軟件包標(biāo)準(zhǔn)流程對數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性降維和聚類。

樣本數(shù)據(jù)整合為了比較不同條件下的細(xì)胞類型和比例，我們采用Seurat［23］教程中所述的整合方法通過Seurat軟件包（v.3.1.0）將來自不同樣本的scRNA-seq數(shù)據(jù)集整合成一個數(shù)據(jù)集，從而將來自不同樣本的細(xì)胞進(jìn)行整合分析。

細(xì)胞的再聚類從PBMCs中提取B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞和先天免疫細(xì)胞（除外NK細(xì)胞）。分別對這幾種主要的細(xì)胞類型再次進(jìn)行歸一化、主成分分析和聚類，以便生成更加精細(xì)的亞群。

細(xì)胞類型注釋在通過UMAP進(jìn)行非線性降維并將所有細(xì)胞投影到二維空間后，細(xì)胞會因?yàn)楸磉_(dá)譜相近而在二維空間中聚集在一起。Seurat中的Find AllMarkers函數(shù)用于查找每個已識別聚類的特異表達(dá)基因。然后將特異表達(dá)基因?qū)φ仗卣餍约?xì)胞標(biāo)志物對聚類進(jìn)行分類和注釋。表達(dá)兩個或多個特征性細(xì)胞標(biāo)志物的聚類被分類為雙峰細(xì)胞，并從進(jìn)一步的分析中排除。

差異表達(dá)基因識別和富集分析使用Seurat中的Find Markers函數(shù)進(jìn)行差異表達(dá)基因（differential expression genes，DEG）分析，并且使用Benjamini-Hochberg方法估計錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）。使用log2（fold change）＞1和FDR＜0.01過濾DEG。使用Metascape網(wǎng)絡(luò)工具（www.metascape.org）對DEG的功能進(jìn)行富集分析。富集基因集為GO Biological Process Ontology。

其他統(tǒng)計分析使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)細(xì)胞亞群的比例在不同分組之間的差異。使用經(jīng)Bonferroni法校正的Dunn’s檢驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞亞群比例兩兩配對檢驗(yàn)。

結(jié) 果

PBMCs的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜為了分析COVID-19患者外周血的免疫學(xué)特征，我們對20名患者和5名健康對照（HC）的PBMCs的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。根據(jù)數(shù)據(jù)庫所提供的臨床表現(xiàn)，將20例COVID-19患者分為4類：重度（severe；n=5；使用呼吸支持治療）、輕度（mild，n=5，未使用呼吸支持治療）、恢復(fù)早期（ERS，n=5，核酸轉(zhuǎn)陰＜7天）、恢復(fù)晚期（LRS，n=5，核酸轉(zhuǎn)陰＞14天）。經(jīng)過質(zhì)控后，共計115 334個高質(zhì)量細(xì)胞及6.5億個獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄本納入下游分析。在這些細(xì)胞中，10 744個細(xì)胞（9.3%）來自重度患者，19 210個細(xì)胞（16.7%）來自輕度患者，31 647個細(xì)胞（27.4%）來自恢復(fù)早期患者，27 994個細(xì)胞（24.2%）來自恢復(fù)晚期患者，25 739個細(xì)胞（22.3%）來自正常對照。將所有高質(zhì)量細(xì)胞整合在一起，并校正測序深度和線粒體轉(zhuǎn)錄本比例后，對所有細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（圖1A）。我們使用UMAP方法根據(jù)已知細(xì)胞標(biāo)志物分離出10種主要的細(xì)胞類型和22種細(xì)胞亞型（圖1A、1B）。主要的細(xì)胞類型包括CD14+單核細(xì)胞（CD14+mono，LYZ+CD14+）、CD16+單核細(xì)胞（CD16+mono，LYZ+FCGR3A+）、2型經(jīng)典型樹突細(xì)胞（cDC2，CD1C+）、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDC，LILRA 4+）、自然殺傷細(xì)胞（NK，KLRF1+）、幼稚狀態(tài)T細(xì)胞（na?ve T，CD3E+CCR7+）、活化狀態(tài)T細(xì)胞（activated T，CD3E+PRF1+）、增殖性T細(xì)胞（proliferative T，CD3E+ MKI67+）、B細(xì) 胞（MS4A 1+）、漿細(xì)胞或漿母細(xì)胞（plasma/plasmablast，MZB1+）。

圖1 健康對照和COVID-19患者的PBMCs單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜Fig 1 Single-cell transcriptional landscape of PBMCs in HC and COVID-19 patients

輕重癥及轉(zhuǎn)歸階段的COVID-19患者PBMCs的組成差異為了揭示重癥、輕癥、恢復(fù)早期和恢復(fù)晚期的COVID-19患者PBMCs的細(xì)胞組成差異并與健康對照進(jìn)行比較（圖2A），我們根據(jù)scRNAseq數(shù)據(jù)計算了每個人PBMCs中10種主要細(xì)胞類型占其所有PBMCs的百分比（圖2B），發(fā)現(xiàn)p DC、cDC2、NK細(xì)胞、增殖性T細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞的外周血占比在疾病的不同階段均有變化（圖2C）：其中，重癥患者PBMCs中pDC的比例明顯低于恢復(fù)早期患者和健康對照，而cDC2的比例明顯低于恢復(fù)晚期患者，提示這兩種DC可能對于疾病康復(fù)有獨(dú)特的作用。與健康對照相比，重癥患者PBMCs中NK細(xì)胞的比例明顯降低，且隨著病情的恢復(fù)，NK細(xì)胞的比例有上升的趨勢。與NK細(xì)胞變化趨勢相反，重癥患者外周血增殖性T細(xì)胞在PBMCs中占比明顯高于恢復(fù)早期和恢復(fù)晚期患者，且隨著病情的恢復(fù)，增殖性T細(xì)胞的比例呈下降趨勢，提示NK細(xì)胞和增殖性T細(xì)胞可以作為病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)衡量患者的臨床狀態(tài)。此外，恢復(fù)早期患者PBMCs中B細(xì)胞的比例在所有分組中最低，且顯著低于輕癥及重癥患者。而令人意外的是，恢復(fù)早期患者的PBMCs中漿細(xì)胞的比例和重癥患者相近，均明顯高于健康對照，也均明顯高于輕癥患者。以上結(jié)果表明，DC、NK細(xì)胞、增殖性T細(xì)胞、B細(xì)胞和漿細(xì)胞在不同狀態(tài)的COVID-19患者，尤其是重癥患者中變化較為明顯，其中參與先天免疫的DC和NK細(xì)胞顯著降低，而參與適應(yīng)性免疫的增殖性T細(xì)胞、B細(xì)胞和漿細(xì)胞顯著增高，提示過高的獲得性免疫反應(yīng)可能為重癥患者多器官功能破壞的潛在原因。

圖2 輕重癥及轉(zhuǎn)歸階段的COVID-19患者PBMCs的細(xì)胞組成差異Fig 2 Differences in cell composition of PBMCsin COVID-19 patients with mild and severeand prognosis states

COVID-19患者先天免疫細(xì)胞亞群的特征從單核細(xì)胞、NK細(xì)胞中提取亞群，并根據(jù)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)和分布定義細(xì)胞亞群類型。共得到8個更加精細(xì)的先天性免疫細(xì)胞亞群（圖3A、B），分別是CD14+單核細(xì)胞（CD14+mono）、CD16+單核細(xì)胞（CD16+mono）、來源于CD14+單核細(xì)胞的炎癥性單核細(xì)胞（infla mono，CD14+AREG+CCL 5+）、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（p DC）、2型經(jīng)典型樹突細(xì)胞（cDC2）、NK細(xì) 胞、XCL 1+NK細(xì) 胞（KLRF1+XCL 1+）和CCL 3+NK細(xì)胞（KLRF1+CCL 3+）。

分析先天免疫細(xì)胞中各亞群在PBMCs中的比例（圖3C），發(fā)現(xiàn)CD14+單核細(xì)胞、炎癥性單核細(xì)胞、pDC細(xì)胞、cDC2細(xì)胞、NK細(xì)胞和XCL 1+NK細(xì)胞在輕重癥及轉(zhuǎn)歸階段的COVID-19患者PBMCs中的占比發(fā)生了變化。其中，與健康對照相比，CD14+單核細(xì)胞的PBMCs占比只在重癥患者中有明顯升高，約為健康對照的2倍；而炎癥性單核細(xì)胞的比例在輕重癥患者，尤其是重癥患者PBMCs中，相比恢復(fù)期患者有顯著升高，是恢復(fù)早期患者的20倍以上，說明炎癥性單核細(xì)胞與COVID-19的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可能在介導(dǎo)多器官損害中發(fā)揮重要作用；在重癥患者PBMCs中幾乎不存在1型干擾素IFNα的主要分泌細(xì)胞p DC，明顯低于健康對照和早期恢復(fù)患者，而其在早期恢復(fù)患者中比例最高，提示p DC及其分泌的IFNα可能有助于機(jī)體的抗病毒免疫反應(yīng)；除了CCL 3+NK細(xì)胞比例在輕癥患者中相比于健康對照無明顯變化外，不同NK細(xì)胞亞群和cDC2在重癥患者PBMCs中的占比相比于恢復(fù)患者和健康對照均呈下降趨勢，與前面的結(jié)果一致。

為了進(jìn)一步研究SARS-CoV-2感染后先天免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組變化，我們將重癥患者和輕癥患者合并為感染期患者組，并比較了感染期患者的單核細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞與健康對照相比在表達(dá)模式上的差異（圖3D～F）。我們發(fā)現(xiàn)，COVID-19感染期患者先天免疫細(xì)胞中上調(diào)的差異表達(dá)基因（DEG）可以富集到免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、IL-12相關(guān)免疫反應(yīng)、髓系細(xì)胞分化、白細(xì)胞活化、細(xì)胞因子產(chǎn)生等通路上。

圖3 先天性免疫細(xì)胞亞群比例及轉(zhuǎn)錄組特征分析Fig 3 Proportion and transcriptome characteristicsof congenital immunecell subsets

COVID-19患者T細(xì)胞亞群的特征為了分析在不同疾病條件下，COVID-19患者T細(xì)胞亞群的變化，我們按照表達(dá)譜，對T細(xì)胞進(jìn)行分群，并根據(jù)T細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)和分布獲得了4個CD4+T細(xì)胞亞型（CD3E+CD4+），以及5個CD8+T細(xì)胞的亞型（CD3E+CD8A+）（圖4A、4B）。

在4個CD4+T細(xì)胞亞型中，我們定義出CD4+初 始T（na?ve T）細(xì) 胞（CD4+CCR7+SELL+）、CD4+細(xì)胞毒性T（cytotoxic T lymphocyte，CTL）細(xì)胞（CD4+GPR183-GZMA+）、CD4+中央記憶性T（central memory T cell，TCM）細(xì) 胞（CD4+GPR183+GZMA-）、調(diào) 節(jié) 性T（Treg）細(xì) 胞（FOXP3+IL 2RA+）。我們發(fā)現(xiàn)，CD4+CTL細(xì)胞既高表達(dá)GNLY，又高表達(dá)TBX21，表明它是1型輔助性T（TH1）細(xì)胞，并高表達(dá)細(xì)胞毒性相關(guān)基因，如NKG7、GZMA、GZMB；CD4+TCM細(xì) 胞 高 表 達(dá)GATA 3，具有2型輔助T（TH 2）細(xì)胞特征，且低表達(dá)上述細(xì)胞毒性相關(guān)基因。CD8+T細(xì)胞中包括1個CD8+初 始（CD8+na?ve）T細(xì)胞 亞 群（CD8+CCR7+SELL+）、1個CD8+細(xì) 胞 毒 性T（CD8+CTL）細(xì)胞亞群（CD8+GNLY+）、2個效應(yīng)記憶性T（effector memory T）細(xì)胞亞群（CD8+GZMK+TEM和CD8+GZMK-TEM），兩者都具有高表達(dá)GZMA和NKG7，但CD8+GZMK+TEM特征性表達(dá)GZMK，而CD8+GZMK-TEM則高表達(dá)GZMB和TBX21。還有一個增殖性CD8+T/NK（proliferative CD8+T/NK）細(xì)胞亞群（CD8+STMN 1+），由于都高表達(dá)增殖性細(xì)胞標(biāo)志物STMN1和MKI67，聚類非常接近。

在分析了不同疾病條件下各個T細(xì)胞亞群在總T細(xì)胞中的占比后，我們發(fā)現(xiàn)僅有GZMK+CD8+TEM細(xì)胞和增殖性CD8+T/NK細(xì)胞在疾病不同時期的占比發(fā)生了明顯變化（圖4C）。我們發(fā)現(xiàn)，在T細(xì)胞中增殖性CD8+T/NK細(xì)胞的比例在重癥患者中顯著高于其他組，且與恢復(fù)晚期患者和健康對照相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示重癥患者中CD8+T/NK細(xì)胞顯著增殖和激活，與在其他感染中觀察到的抗病毒反應(yīng)一致。而GZMK+CD8+TEM細(xì)胞的T細(xì)胞占比僅在輕癥患者中明顯高于恢復(fù)期患者。CD8+na?ve T細(xì)胞占比在各組間的差異雖然沒達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義，但恢復(fù)組占比為其他組的2～3倍。

為了進(jìn)一步研究SARS-CoV-2感染后T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的變化，我們對成熟T細(xì)胞（CTL、TEM、TCM）進(jìn)行了評估。與健康對照相比，疾病期和康復(fù)期患者的成熟T細(xì)胞中上調(diào)的DEG所富集到的通路既有相似的通路，又有不同的通路。與健康對照相比，在疾病期和康復(fù)期患者的成熟T細(xì)胞具有高表達(dá)基因的功能（圖4D、4E），與T細(xì)胞活化、淋巴細(xì)胞增殖、白細(xì)胞激活以及先天免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的相關(guān)基因表達(dá)均有上調(diào)。但在疾病期患者的成熟T細(xì)胞中，與IL-12、IL-7和IFN-γ信號通路相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)；而在康復(fù)期患者中，與免疫系統(tǒng)負(fù)調(diào)控相關(guān)的基因表達(dá)有所上調(diào)。提示在疾病進(jìn)展到康復(fù)期后，機(jī)體的免疫強(qiáng)度逐步下調(diào)。

圖4 T細(xì)胞各亞群占比和轉(zhuǎn)錄組特征分析Fig 4 Proportion and transcriptome characteristics of T cell subsets

COVID-19患者B細(xì)胞亞群的特征我們根據(jù)B細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)和分布將B細(xì)胞分為4個亞群，包括1個初始B（na?ve B）細(xì)胞亞群（MS4A 1+IGHD+CD27-）、1個記憶B細(xì)胞（memory B）亞群（MS4A 1+CD27+IGHD-）、1個 中 間 記 憶B（intermediate B）細(xì)胞亞群（IGHD+CD27+）和1個漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞（plasma/plasmablast）亞群（MZB1+CD38+）（圖5A、B）。

在分析了不同疾病狀態(tài)下各個B細(xì)胞亞群的PBMCs占比（圖5C）和B細(xì)胞占比后（圖5D），我們發(fā)現(xiàn)，重癥患者的na?ve B細(xì)胞和中間記憶B細(xì)胞亞群的PBMCs占比明顯高于恢復(fù)早期患者，但這兩個亞群的B細(xì)胞占比在不同疾病狀態(tài)下沒有明顯差異。重癥患者的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞亞群的PBMCs占比最高，次高為早期恢復(fù)患者，均明顯高于輕癥患者和健康對照；在B細(xì)胞中，早期恢復(fù)患者的漿細(xì)胞和漿母細(xì)胞亞群的B細(xì)胞占比最高，次高為重癥患者，均明顯高于輕癥患者和健康對照。提示重癥患者在B細(xì)胞數(shù)目上升的同時，B細(xì)胞各亞群的比例保持穩(wěn)定，推測SARS-CoV-2感染對體液免疫的影響有限，體液免疫的正常激活使得na?ve B細(xì)胞源源不斷分化成漿細(xì)胞和記憶B細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞，促進(jìn)疾病向康復(fù)方向進(jìn)展。

為了進(jìn)一步研究SARS-CoV-2感染后B細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組發(fā)生的變化，我們分析了疾病期和康復(fù)期患者的B細(xì)胞與正常對照之間的表達(dá)譜變化（圖5E、F）。我們發(fā)現(xiàn)，在疾病期、康復(fù)期均有和白細(xì)胞活化、白細(xì)胞黏附、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、外源性肽抗原的處理和呈遞、蛋白質(zhì)合成等生物學(xué)過程相關(guān)的基因發(fā)生了上調(diào)，表明B細(xì)胞的功能在疾病期有所增強(qiáng)，且直至康復(fù)期都未恢復(fù)正常水平。在疾病期，B細(xì)胞中與正向調(diào)節(jié)IL-12生成相關(guān)的基因被富集，說明疾病期的B細(xì)胞可以顯著增強(qiáng)NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的功能。在康復(fù)期，B細(xì)胞中與凋亡信號相關(guān)的基因被富集，這可能是康復(fù)期患者外周血中B細(xì)胞比例降低的原因之一。

圖5 B細(xì)胞各亞群占比及轉(zhuǎn)錄組特征分析Fig 5 The proportion and transcriptomecharacteristics of subsets of B cell

討 論

盡管尚不清楚SARS-CoV-2感染是否會導(dǎo)致無癥狀攜帶者的后遺癥，但COVID-19通常被認(rèn)為是一種急性自限性疾病［24］。雖然宿主對急性SARS-CoV-2感染的免疫應(yīng)答可以清除機(jī)體中的病毒，然而不受控制的炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致COVID-19患者器官和組織的損傷，從而決定了疾病的嚴(yán)重程度、進(jìn)展和結(jié)局［2］。已有研究報道了SARS-CoV-2感染導(dǎo)致的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的特點(diǎn)［12，16，25］，這有助于我們了解疾病的潛在發(fā)病機(jī)制。然而，SARS-CoV-2感染后免疫反應(yīng)的綜合情況難以獲得。為了解決這一問題，我們構(gòu)建了輕重癥及轉(zhuǎn)歸階段的COVID-19患者單細(xì)胞免疫圖譜，分析了在疾病進(jìn)展過程中細(xì)胞反應(yīng)的動態(tài)變化，揭示了機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)和COVID-19發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因素。

我們的研究為COVID-19患者的免疫學(xué)研究提供了無偏倚的補(bǔ)充。首先，COVID-19患者IL-12相關(guān)免疫反應(yīng)、急性炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞遷移能力均有所增強(qiáng)。其次，在COVID-19患者中觀察到廣泛的免疫激活，這可以通過增殖性T細(xì)胞、漿細(xì)胞和炎癥性單核細(xì)胞的比例增加以及cDC2、pDC和NK細(xì)胞的比例降低來證明。再次，CD8+GZMK+TEM細(xì)胞亞群的比例在感染期患者中明顯升高，且輕癥患者的CD8+GZMK+TEM比例高于重癥患者，可能說明該亞群的衰竭會加重病情進(jìn)展。最后，盡管大多數(shù)患者的臨床參數(shù)在恢復(fù)早期就到了正常范圍，但免疫系統(tǒng)的狀態(tài)并未完全恢復(fù)，例如NK細(xì)胞和XCL 1+NK細(xì)胞在恢復(fù)晚期仍未正常。我們發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)期患者PBMCs中免疫激活相關(guān)的基因仍然上調(diào)，或可解釋部分患者在出院后產(chǎn)生的后遺癥。因此，需要進(jìn)行長期隨訪研究，以確定COVID-19患者免疫完全恢復(fù)需要的時間。

之前發(fā)現(xiàn)COVID-19重癥患者的支氣管肺泡灌洗液中有大量巨噬細(xì)胞［19］，且主要是由外周血中的炎癥性單核細(xì)胞分化而來，而不是已有的肺泡巨噬細(xì)胞。這類炎癥性單核細(xì)胞不僅高表達(dá)CD14、FCN1等外周單核細(xì)胞標(biāo)記物，且高表達(dá)CCL5、NFKB、AREG等炎癥細(xì)胞標(biāo)志物，具有經(jīng)典M 1巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)特征。這與我們在外周血中的發(fā)現(xiàn)相符，我們在PBMCs中發(fā)現(xiàn)，重癥患者CD14+單核細(xì)胞顯著擴(kuò)增，疾病期患者PBMC中炎癥性單核細(xì)胞比例也明顯增加，這可以很好地解釋COVID-19患者肺組織中巨噬細(xì)胞增多。TLR/IL-1R信號刺激會激活炎癥單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞［26］。最近的研究表明，抑制TLR/IL-1R信號級聯(lián)反映可減輕重癥COVID-19患者的高炎癥狀態(tài)［27］。

我們發(fā)現(xiàn)，在重癥COVID-19患者中，外周血中NK細(xì)胞耗竭，這與已知研究相一致［28］。之前有研究發(fā)現(xiàn)，重癥COVID-19患者的NK細(xì)胞中NKG2A表達(dá)升高，從而抑制CLT細(xì)胞的細(xì)胞毒性，而外周血中NKG2A降低、NK細(xì)胞衰竭逆轉(zhuǎn)則與COVID-19的恢復(fù)成正相關(guān)［29］。NK細(xì)胞耗竭可能是重癥患者多器官損傷的重要原因。在我們的研究中，還發(fā)現(xiàn)了一類高表達(dá)XCL1+的NK細(xì)胞在重癥患者PBMCs中顯著升高。cDC1表達(dá)XCR1，這是XCL 1的唯一受體［30］，NK細(xì)胞通過表達(dá)XCL 1，進(jìn)而招募cDC1進(jìn)入相應(yīng)組織。cDC1可介導(dǎo)有效識別病毒和細(xì)胞內(nèi)抗原，有抗原遞呈和產(chǎn)生Ⅲ型干擾素的作用，針對病毒感染發(fā)揮先天性免疫的作用［31］。因此，重癥患者XCL 1+的NK細(xì)胞減少，將嚴(yán)重影響cDC1的抗病毒作用，從而影響COVID-19預(yù)后。

cDC2不僅是高效的抗原提呈細(xì)胞，而且還分泌IL-1、IL-8、IL-10、IL-12、IL-23和腫瘤壞死因子α（TNF-α），因此，cDC2細(xì)胞可以激活Th1、Th2、Th17和CD8+T細(xì)胞［32］；而p DC細(xì)胞通過分泌大量Ⅰ型和Ⅲ型干擾素以及細(xì)胞因子，特異性應(yīng)對病毒性感染。然而，我們發(fā)現(xiàn)cDC2細(xì)胞和pDC細(xì)胞在重癥患者PBMCs中比例較低，而在恢復(fù)期有升高趨勢，其中cDC2細(xì)胞在恢復(fù)晚期而pDC細(xì)胞在恢復(fù)早期，在PBMCs中的比例明顯超過重癥患者。推測是由于重癥患者cDC2細(xì)胞和p DC細(xì)胞的分化受限，患者對SARS-CoV-2感染的先天免疫力產(chǎn)生缺陷，并導(dǎo)致這兩種細(xì)胞在恢復(fù)期反跳性升高。

我們發(fā)現(xiàn)，在T細(xì)胞中，輕癥患者GZMK+CD8+TEM細(xì)胞比例明顯高于恢復(fù)期患者。此外我們發(fā)現(xiàn)，和GZMK-CD8+TEM相比，GZMK+CD8+TEM低表達(dá)NKG7、GZMA、GZMB、GNLY等細(xì)胞毒性相關(guān)基因，因此，輕癥患者擴(kuò)增的CD8+TEM亞群細(xì)胞毒性較低。這可能是輕癥患者的免疫系統(tǒng)得以在抗病毒的同時避免免疫損傷的原因。增殖性CD8+T/NK細(xì)胞的T細(xì)胞占比在重癥患者中顯著上升，明顯高于正常對照。在其余T細(xì)胞亞群中，我們并未發(fā)現(xiàn)重癥患者T細(xì)胞中占比升高的細(xì)胞亞群。有報道［16］稱，在重癥患者PBMCs中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的絕對數(shù)目均有降低，因此可以推測，重癥患者T細(xì)胞的減少是由于破壞或凋亡增加所引起，并導(dǎo)致T細(xì)胞增殖加快。

我們注意到，與恢復(fù)早期患者相比，重癥患者PBMCs中初始B細(xì)胞和中間型B細(xì)胞的比例明顯升高，據(jù)此推測重癥患者的免疫系統(tǒng)加快了B細(xì)胞的生成和轉(zhuǎn)化，從而增強(qiáng)機(jī)體抗病毒的能力。因此，我們也能看到重癥患者PBMCs中漿細(xì)胞/漿母細(xì)胞的擴(kuò)增。盡管早期恢復(fù)患者PBMCs中初始B細(xì)胞和中間型B細(xì)胞的比例較低，但其漿細(xì)胞/漿母細(xì)胞的比例卻高于健康對照和輕癥患者，僅次于重癥患者PBMCs。我們推斷，輕癥患者由于病毒負(fù)荷較低，抗原遞呈不足，導(dǎo)致體液免疫激活延遲，在恢復(fù)早期才有一定的漿細(xì)胞；而重癥患者體液免疫持續(xù)激活，在恢復(fù)早期仍保持足夠多的漿細(xì)胞。

本研究存在局限性：樣本量相對較小，且來自不同的實(shí)驗(yàn)室。因此，批次效應(yīng)難以控制，需要對更多COVID-19患者的數(shù)據(jù)進(jìn)行研究，以便確定不同細(xì)胞類型的免疫特征與疾病結(jié)局之間的因果關(guān)系。

綜上所述，本研究中綜合性高分辨率的分析結(jié)果為研究COVID-19發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜動態(tài)免疫反應(yīng)提供了基礎(chǔ)，為深入了解COVID-19患者的外周血淋巴細(xì)胞提供了資源，并為設(shè)計減輕COVID-19損傷的療法提供了幫助。

作者貢獻(xiàn)聲明王正 論文構(gòu)思、撰寫和修訂，數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。張倩月 數(shù)據(jù)采集和分析，論文修訂。宋懷東 論文構(gòu)思和修訂，數(shù)據(jù)分析指導(dǎo)。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。