韓 春 唐 峰 項耀鈞

（1海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院院辦 上海 200433；2上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院病理科 上海 200040；3復旦大學附屬華山醫(yī)院病理科 上海 200040；4上海藍十字腦科醫(yī)院院辦 上海 201101）

膠質瘤是最常見的顱內腫瘤，占顱內原發(fā)腫瘤的60%～80%［1-2］，發(fā)病率高、容易復發(fā)且難以治愈［3］。膠質瘤治療以手術為主，輔以術后放化療［4］，故腫瘤的病理分類、分級對患者的個體化治療和預后判斷非常重要。病理診斷結果與免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）技術密不可分，但在實際工作中發(fā)現(xiàn)IHC結果的穩(wěn)定性和準確性受到很多因素影響，如組織處理、染色方法、判讀標準等［5-6］。其中，組織固定是影響組織標本形態(tài)結構、細胞抗原保存及檢測結果的重要因素。組織固定是固定液中甲醛的醛基與組織抗原決定簇的蛋白及側鏈上的氨基起縮合反應，封閉細胞內抗原的活性，這是固定劑對抗原的交聯(lián)封閉作用［7］。目前，國內外關于人腦標本經(jīng)不同固定時間處理后IHC結果的研究報道較少見，國外研究主要為動物腦組織［8］和死亡后的人腦標本［9］。本研究以膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）和增殖指數(shù)（proliferation index，Ki67）為目標抗原，對不同固定時間處理后的腦膠質瘤標本行IHC染色，探討腦腫瘤標本固定時長對IHC結果的影響，確定使腦腫瘤標本IHC結果穩(wěn)定準確的固定時長范圍，從而為腦腫瘤IHC的質量控制提供參考依據(jù)。

資料和方法

病例資料回顧性收集2018年1月至2019年12月上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院71例腦膠質瘤標本，其中男性38例，女性33例，年齡15～78歲，平均年齡49歲。71例腦膠質瘤的病例中，低級別膠質瘤17例，其中節(jié)細胞膠質瘤（Ⅰ級）3例、毛細胞型星形細胞瘤（Ⅰ級）1例、CD34陽性的低級別膠質瘤（Ⅰ級）3例、星形細胞瘤（Ⅱ級）9例、少突星形細胞瘤（Ⅱ級）1例；高級別膠質瘤54例，其中間變性星形細胞瘤（Ⅲ級）17例、膠質母細胞瘤（Ⅳ級）37例。

納入標準：（1）年齡＜80歲；（2）一般情況良好；（3）原發(fā)性腦腫瘤；（4）影像學（MRI）資料顯示腫瘤直徑≥2 cm；（5）病理常規(guī)石蠟證實為膠質瘤。排除標準：（1）腦以外的膠質瘤；（2）合并嚴重的內科疾病；（3）合并其他惡性腫瘤；（4）術前接受過靶向、放射、化學藥物、伽馬刀等醫(yī)學治療方式。在神經(jīng)外科醫(yī)師的協(xié)助下，獲得患者知情同意。

取材方法將手術切除的標本立即固定于4%甲醛（本院中心實驗室配置）中，送至病理科，即刻取材，每例標本取6塊含腫瘤的組織，大小為1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm，盡量附帶周圍腦組織，固定時間依次為4 h、24 h、48 h、96 h、7 d和14 d。

制片方法固定后的標本經(jīng)脫水、石蠟包埋和切片。切片分為常規(guī)HE切片和IHC防脫切片，厚度為3μm。HE切片染色后確定為目標標本，再對IHC防脫切片進行GFAP、Ki67 IHC染色。用于IHC的切片在65℃烤箱中烤片過夜，采用SP法，由Dako Link48自動免疫組化機進行染色。染色所用的抗體均經(jīng)過質量控制；標本在染色過程中設立陽性、陰性對照。GFAP陽性對照選擇正常腦組織，陰性對照選擇自淋巴組織；Ki67陽性對照選擇自淋巴組織，陰性對照選擇正常腦組織。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，陽性細胞呈黃褐色，蘇木精復染，背景陰性細胞呈藍色。脫水、透明、封片后，Nikon光學顯微鏡不同倍數(shù)物鏡下觀察。固定液為4%甲醛，一抗選用長島生物技術有限公司的工作液：鼠抗GFAP（克隆號：GA-5）、Ki67（克隆號：SP6）；二抗選用Dako公司自動免疫組化儀器的配套抗體。

結果判讀依據(jù)IHC陽性細胞按陽性程度不同呈現(xiàn)黃色、棕黃色、褐色。免疫標記物GFAP和Ki67的著色部位分別是細胞質和細胞核。

IHC染色結果分析參考Allred score標準［10］，這一評分標準的優(yōu)點在于最大程度去除主觀判斷誤差：首先對陽性細胞數(shù)量與陽性強度分別評分，再將二者分值相加為Allred評分（0～8分）。細胞陽性表達強度：無著色、黃色、棕黃色和褐色分別設定為0、1、2和3分。GFAP陽性細胞數(shù)目：無、＜1%、1%～10%、11%～33%、34%～66%和67%～100%分別設定為0、1、2、3、4和5分；Ki67陽性細胞數(shù)目：無、＜1%、1%～4%、5%～10%、11%～20%和＞20%分別設定為0、1、2、3、4和5分。將以上兩項分數(shù)分別相加，結果0分為（-），2～4分為弱陽（+），5～6分為中陽（++），7～8分為強陽（+++），陽性結果（++）及以上作為GFAP、Ki67有效陽性表達。所有結果均采用人工計數(shù)，由兩位資深的病理科醫(yī)師在光鏡下獨立完成并記錄，最后進行綜合評估，分組計算有效陽性率（即有效陽性表達所占比例）。

統(tǒng)計學方法研究結果采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

肉眼觀察71例標本均為灰白灰褐色，組織最大徑2～9 cm，質地偏韌，其中3例有囊變，1例有沙礫感。

IHC鏡檢腦膠質瘤標本經(jīng)不同固定時間處理后，GFAP、Ki67的陽性表達情況見圖1～2。固定時間不同，GFAP、Ki67陽性染色有差異，直接影響病理診斷中陽性判讀結果。

圖1 GFAP在不同固定時間的腦膠質瘤標本中的陽性表達（HE染色，×200）Fig 1 Positive expressions of GFAPin brain glioma specimenstreated with different fixation time（HE staining，×200）

圖2 Ki67在不同固定時間腦膠質瘤標本中的陽性表達（HE染色，×200）Fig 2 Positive expressions of Ki67 in brain glioma specimens treated with different fixation time（HE staining，×200）

在4%甲醛固定液中固定4 h、24 h、48 h、96 h、7 d和14 d的腦膠質瘤標本，經(jīng)過組織處理后，進行免疫標記物染色，GFAP有效陽性率分別為63.38%、97.18%、95.77%、92.95%、90.14%和77.46%，Ki67有效陽性率分別為87.32%、100%、100%、100%、98.59%和90.14%（表1～2）。

表1 不同固定時間處理后GFAP在腦膠質瘤中的有效陽性表達結果Tab 1 Valid positive expression of GFAPin brain glioma treated with different fixation time （n=71）

表2 不同固定時間處理后Ki67在腦膠質瘤中的有效陽性表達結果Tab 2 Valid positive expression of Ki67 in brain glioma treated with different fixation time （n=71）

GFAP、Ki67有效陽性結果統(tǒng)計分析

GFAP 腦膠質瘤標本固定4 h、24 h、48 h、96 h、7 d和14 d后，比較GFAP的有效陽性率，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=51.802，P＜0.001）。兩兩組間比較發(fā)現(xiàn)，固定24 h、48 h、96 h和7 d的GFAP有效陽性率差異無統(tǒng)計學意義；固定24 h、48 h、96 h和7 d的GFAP有效陽性率顯著高于固定4 h和14 d，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明固定時間過短或太長都會影響GFAP染色結果（表3）。

表3 不同固定時間的GFAP有效陽性率組間比較Tab 3 Comparison of valid positive rate of GFAPtreated with different fixation time （n=71）

Ki67 腦膠質瘤標本固定4 h、24 h、48 h、96 h、7 d和14 d，比較Ki67的有效陽性率，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=30.450，P＜0.001）。進一步進行兩兩組間比較發(fā)現(xiàn)，固定24 h、48 h、96 h和7 d，Ki67有效陽性率差異無統(tǒng)計學意義；固定24 h、48 h、96 h和7 d的Ki67有效陽性率高于固定4 h和14 d，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明固定時間過短或太長都會影響Ki67染色結果（表4）。

表4 在不同固定時間分組中Ki67有效陽性率組間比較Tab 4 Comparison of valid positive rate of Ki67 treated with different fixation time （n=71）

討 論

研究發(fā)現(xiàn)，組織標本在固定過程中，抗原活性與固定時間直接相關，固定時間過短會造成固定不均勻，固定液不能完全滲透到組織內部，部分抗原失活；固定時間過長會使組織變得脆硬，抗原減少或 定 位 不 準［7，11］。本 研 究 中 組 織 樣 本 固 定24 h、48 h、96和7 d后GFAP、Ki67的IHC染色結果較好，固定4 h的標本IHC染色陽性率明顯低于固定24 h、48 h、96 h和7 d的標本，與何蕾蕾等［11］在不同固定時間對乳腺浸潤性癌ER、PR免疫組化染色影響的研究結果基本一致；固定24 h～14 d的標本IHC染色陽性結果呈下降趨勢，與Aniol等［8］延長鼠海馬固定時間對PCNA和DCX免疫染色結果的影響相符，兩種抗原在組織固定7 d或更長時間后免疫陽性下降。張共和等［12］在神經(jīng)元-nAchR免疫反應的研究中發(fā)現(xiàn)，固定時間過長直接影響免疫組化結果。不同器官組織在不同固定時長下的IHC染色結果有差異，喬秀玲等［13］研究了不同固定液和不同固定時間對大腸癌淋巴結免疫組化染色的影響，指出淋巴結最佳免疫組化染色效果的固定時間為6～12 h，固定時間越長，免疫染色效果越差。Kai等［14］發(fā)現(xiàn)不同固定時間處理的相同外科手術胃癌標本在7 d內Her-2和PD-L1表達無明顯差異。因此認為，組織的固定時長對IHC染色結果有重要影響，不同組織器官最佳IHC染色效果的固定時長也不同。

本研究中，固定24 h、4 h、96 h和7 d的GFAP和Ki67的IHC染色結果優(yōu)于固定4 h和14 d。固定4 h的GFAP和Ki67陽性率明顯低于固定24 h、48 h、96 h和7 d，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明新鮮標本的固定時間太短，腫瘤組織內部固定不充分，抗原活性減低，導致免疫標記物的陽性表達率下降。固定14 d的GFAP和Ki67陽性率低于固定24 h、48 h、96 h和7 d，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明新鮮標本的固定時間過長，會導致組織內抗原活性減低，免疫標記物的陽性率下降。

本次研究的不足之處在于：（1）單中心實驗，樣本量較小，還需要更多樣本量來驗證；（2）在4 h和24 h之間以及14 d之后未設觀察組，設立的組別越多，實驗結果的準確性越高；（3）僅選擇2種免疫標記物進行研究，今后的研究范圍可擴大到更多腫瘤相關抗原，以了解不同抗原表達與固定時長的關系，更有利于輔助病理診斷。

綜上所述，人腦膠質瘤標本的固定時間對GFAP和Ki67表達有影響，為腦腫瘤標本的IHC室內質量控制提供了參考。在病理工作中要控制好標本的固定時間，避免固定不足或過度，從而提高免疫組化染色質量，得出準確可靠的判讀結果，以輔助病理診斷。

作者貢獻聲明韓春 病例收集，切片判讀，論文構思、撰寫和修訂。唐峰 論文設計和指導，切片判讀，結果分析。項耀鈞 論文指導和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。