唐 瑤 龔小會(huì) 劉海燕 顧蔚蓉 李笑天，2 彭 婷△

（1復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)科 上海 200011；2上海市女性生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200011）

早產(chǎn)是指孕周不足37周的胎兒娩出。早產(chǎn)兒的器官發(fā)育不成熟，出生后近期及遠(yuǎn)期的患病率和死亡率均顯著升高［1］。根據(jù)WHO的數(shù)據(jù)，全球每年約數(shù)百萬的新生兒死于早產(chǎn)相關(guān)并發(fā)癥，早產(chǎn)也是我國繼肺炎后低于5歲兒童死亡的最常見原因［1-2］。除外醫(yī)源性早產(chǎn)，自發(fā)性早產(chǎn)是早產(chǎn)的主要原因。但是其發(fā)病機(jī)制不清，缺乏及時(shí)有效的干預(yù)措施。

妊娠子宮由靜息至收縮表型轉(zhuǎn)化導(dǎo)致提前不可逆的產(chǎn)程發(fā)動(dòng)是自發(fā)性早產(chǎn)的主要特征，而miRNA被認(rèn)為是子宮平滑肌轉(zhuǎn)化過程中的重要調(diào)控分子［3-4］。在子宮平滑肌細(xì)胞中，miR-200家族分子調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子ZEB1、ZEB2和STAT 5B，而miR-199a-3p/miR-214調(diào)控靶基因PTGS2，它們的互相作用與雌孕激素對產(chǎn)程的調(diào)控密切相關(guān)［5-6］。本課題組也發(fā)現(xiàn)一系列miRNA在自發(fā)性早產(chǎn)臨產(chǎn)的子宮平滑肌中表達(dá)失常，其中miR-212-3p與炎癥導(dǎo)致早產(chǎn)子宮平滑肌功能異常密切相關(guān)［4，7］。研究顯示，miRNA能夠通過旁分泌或外泌體分泌等方式至外周循環(huán)成為游離的miRNA，后者可以局部自我調(diào)控或者作用于其他部位靶基因，參與疾病局部或全身的進(jìn)展。早產(chǎn)孕婦血液中的確存在一系列表達(dá)失常的游離miRNA，研究者們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)自發(fā)性早產(chǎn)患者血清中與宮頸長度、妊娠時(shí)長、巨大兒以及胎兒性別等有關(guān)的循環(huán)miRNAs［8-10］。但是妊娠子宮作為自發(fā)性早產(chǎn)核心器官，血清中與子宮平滑肌相關(guān)的miRNAs探索卻沒有獲得關(guān)注［11］。

在我們前期發(fā)現(xiàn)的早產(chǎn)子宮平滑肌相關(guān)miRNAs中，miR-212-3p經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)與妊娠子宮平滑肌炎癥應(yīng)激有關(guān)，miR-26b-5p和miR-223-3p分別調(diào)控全身炎性反應(yīng)的關(guān)鍵基因和炎癥小體NLRP3，存 在 參 與 早 產(chǎn) 的 理 論 基 礎(chǔ)［4，12-13］；miRNA-936和miR-4746-3p因在早產(chǎn)子宮平滑肌中表達(dá)豐度相對較高，有穩(wěn)定合適的商業(yè)合成引物，檢測的重復(fù)性較好，因此被納入研究。最后，與雌孕激素調(diào)節(jié)產(chǎn)程密切相關(guān)的miR-199a-3p/miR-214家族也是有價(jià)值的研究靶點(diǎn)［6］。為了找到早產(chǎn)血清特異的miRNA分子，本課題擬從上述8個(gè)miRNAs著手，采用病例-對照研究，應(yīng)用定制Real-time PCR法尋找自發(fā)性早產(chǎn)患者血清中表達(dá)失常的miRNA，并通過生物信息學(xué)工具預(yù)測和構(gòu)建相關(guān)miRNA的作用網(wǎng)絡(luò)，以了解其可能的作用，為后續(xù)早產(chǎn)機(jī)制研究提供新的方向。

資料和方法

研究對象和標(biāo)本采集采用病例-對照研究，收集2017年5月—2018年8月間復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)檢和分娩孕婦的臨床資料和血清，包括自發(fā)性早產(chǎn)42例（病例組）和正常妊娠32例（對照組）。自發(fā)性早產(chǎn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)同早產(chǎn)臨產(chǎn)：妊娠滿28周至不滿37周前出現(xiàn)的規(guī)律子宮收縮（每20 min 4次或每60 min內(nèi)8次，間隔5～6 min，持續(xù)時(shí)間達(dá)30 s以上），伴隨宮口擴(kuò)張≥2 cm。對照組為同期于我院產(chǎn)檢的未足月的孕晚期產(chǎn)檢正常妊娠產(chǎn)婦，無腹痛腹脹或陰道流液。兩組的排除標(biāo)準(zhǔn)包括：多胎妊娠，輔助生殖，妊娠合并子宮肌瘤，妊娠合并子宮畸形，胎盤植入，胎盤前置，胎兒畸形，生殖道感染、發(fā)熱以及內(nèi)科（孕前糖尿病、血液系統(tǒng)或者免疫系統(tǒng)疾病）或者外科合并癥（膽囊炎、闌尾炎或胰腺炎）?；颊呷虢M后即刻采集5 mL的外周靜脈血，早產(chǎn)組血樣均采集于患者診斷為自發(fā)性早產(chǎn)診斷時(shí)，且在患者診斷時(shí)（即入組時(shí)）均進(jìn)行了感染指標(biāo)檢測，包括生殖道病原學(xué)培養(yǎng)、血常規(guī)和CRP；非早產(chǎn)組招募自妊娠32～34周常規(guī)進(jìn)行血檢的孕婦，入組時(shí)均進(jìn)行了血常規(guī)檢驗(yàn)。

全血樣本于常溫促凝管中靜置30 min，然后于低溫離心機(jī)1 900×g離心10 min，上清液吸出后分裝并保存于-80℃冰箱?；颊咭话闩R床資料的采集包括年齡、產(chǎn)孕次、BMI、是否有妊娠期合并癥，通過電子檔案采集了早產(chǎn)組和非早產(chǎn)組病人的血常規(guī)報(bào)告以及早產(chǎn)組病人的病原學(xué)培養(yǎng)和CRP報(bào)告；該研究需隨訪至分娩后，獲得的妊娠結(jié)局資料包括分娩孕周及新生兒體重及APGAR評分。本研究獲得了復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批件號2017-15），所有患者均簽署書面知情同意書。

Real-time PCR檢驗(yàn)根據(jù)試劑盒的步驟，取200μL的血清加入Trizol裂解液，并在其中加入3.5μL cel-mir-39-3p的工作液作為外參以監(jiān)測miRNA提取和逆轉(zhuǎn)錄的效率，采用離心柱法提取血清中的總RNA，隨后進(jìn)行cDNA合成，所有試劑盒采購自德國QIAGEN公司（貨號217184和218161）?；贏BI 7500 HT實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，采用miScript SYBR Real time PCR試劑盒（貨號218073）和定制化miScript miRNA PCR板（貨號331231），同時(shí)檢測血清中8條候選miRNA（包括

miR-199a-3p，miR-936，miR-4746-3p，miR-26b-5p，miR-214-3p，miR-214-5p，miR-212-3p和miR-223-3p），3條候選內(nèi)參miRNA（包括miR-16-5p，let-7d-5p和RNU 6-6P）以及cel-mir-39-3p、陰性和陽性對照作為質(zhì)控。定制化PCR板中的引物均來自QIAGEN已商品化的產(chǎn)品。PCR反應(yīng)采用10μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min，然后94℃變性15 s、55℃退火30 s和70℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)后反應(yīng)結(jié)束，確認(rèn)Real-time PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，進(jìn)行PCR相對定量。目的基因miRNA的表達(dá)水平根據(jù)PCR擴(kuò)增曲線所得CT值，CT值的閾值設(shè)置為40。基于Norm finder算法［14］，計(jì)算3條候選內(nèi)參hsa-miR-16-5p，let-7d-5p和RNU6-6P的穩(wěn)定系數(shù)，并選擇表達(dá)最為穩(wěn)定的分子作為內(nèi)參，比較內(nèi)參基因與目的基因的CT值，得出各標(biāo)本之間目的基因表達(dá)量的多少。計(jì)算公式：ΔCT=

生物信息學(xué)分析采用數(shù)據(jù)庫miRDB（mirdb.org）和miRTarBase（mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw）同時(shí)預(yù)測差異表達(dá)miRNA的靶基因，預(yù)測結(jié)果的交集作為差異表達(dá)miRNA的靶基因并納入后續(xù)分析。采用STRING（string-db.org）獲得靶基因互相關(guān)系后，基于MNC算法計(jì)算靶基因中的熱點(diǎn)基因，取排在前50位的熱點(diǎn)基因信息，導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行生物學(xué)通路的富集分析及熱點(diǎn)基因互作網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建［15］。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件分析，連續(xù)性變量采用±s或中位數(shù)M（IQR）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。連續(xù)性變量的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Benjamini-Hochberg法對多次組間比較的P值進(jìn)行矯正，矯正后FDR＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

早產(chǎn)和非早產(chǎn)孕婦臨床資料比較研究共納入42位早產(chǎn)孕婦和32位非早產(chǎn)孕婦，一般情況及臨床特征見表1。兩組在入組年齡、初產(chǎn)婦比例、采樣孕周、體重指數(shù)、妊娠期高血壓疾病及妊娠期糖尿病方面無顯著差異。早產(chǎn)組全血白細(xì)胞數(shù)目（white blood cell，WBC）和中性粒細(xì)胞數(shù)目（neutrophils，N）均顯著高于非早產(chǎn)組（P均＜0.05，表1）。早產(chǎn)組中，5例感染指標(biāo)C-反應(yīng)蛋白（C-reaction protein，CRP）升高，測量值分別為10、10、32、34、42 mg/L（參考范圍＜10 mg/L，低于10 mg/L不回報(bào)數(shù)值）；7例生殖道病原體培養(yǎng)結(jié)果異常，產(chǎn)后回報(bào)為解脲支原體攜帶者（參考范圍：陰性）。

表1 研究對象的臨床特征和妊娠結(jié)局Tab 1 Clinical characteristicsand pregnancy outcomes of the studied population

非早產(chǎn)組中有3例患者于本機(jī)構(gòu)外分娩，她們在本機(jī)構(gòu)末次產(chǎn)前檢查時(shí)間均為孕37周后，電話隨訪后確定分娩結(jié)局，患者均否認(rèn)新生兒不良結(jié)局。早產(chǎn)組胎兒的分娩體重顯著低于非早產(chǎn)組胎兒的出生體重（P＜0.001），兩組胎兒性別比例無顯著差異（P=0.33）。本研究中，早產(chǎn)組的3例患兒1 min Apgar評分7分，復(fù)蘇后出生5 min Apgar評分均恢復(fù)正常。非早產(chǎn)組的新生兒出生Apgar評分和5 min后Apgar評分均正常范圍內(nèi)。

早產(chǎn)和非早產(chǎn)組的血清miRNA表達(dá)情況比較根據(jù)Normfinder算法，穩(wěn)定值數(shù)值越小、分子表達(dá)越穩(wěn)定。本研究中候選內(nèi)參miR-16-5p、let-7d-5p和RNU 6-6P的穩(wěn)定值分別為0.44、0.16和0.66，故以let-7d-5p為內(nèi)參計(jì)算血清miRNA分子的相對表達(dá)量。表2展示了目標(biāo)血清miRNAs的相對表達(dá)水平及組間比較，早產(chǎn)組孕婦血清miR-936和miR-26b-5p的相對表達(dá)量較非早產(chǎn)組的分子相對表達(dá)量顯著升高（FDR均為0.036）。

表2 早產(chǎn)組和非早產(chǎn)組血清miRNA相對表達(dá)情況及比較Tab 2 Comparison of the relative expression levels of circulated miRNAs in NPand PTL groups

不同白細(xì)胞水平早產(chǎn)和非早產(chǎn)組的血清miRNA表達(dá)情況比較妊娠期WBC無公認(rèn)的參考范圍，因此基于ROC受試者曲線取約登指數(shù)最大處的WBC值作為截?cái)嘀担碬BC=10.55×109/L），將所有人再次分為WBC升高組和WBC正常組（表3）。WBC升高組的23人中僅包括了4例非早產(chǎn)人群。WBC正常組共51人，早產(chǎn)和非早產(chǎn)人群比例相當(dāng)。WBC升高組中，miR-936和miR-26b-5p在早產(chǎn)中雖表現(xiàn)出升高趨勢但不顯著。在WBC正常組中，miR-26b-5p和miR-936在早產(chǎn)人群中均顯著升高（P均＜0.05）。

表3 以WBC水平分層后早產(chǎn)組和非早產(chǎn)組血清miRNA相對表達(dá)情況及比較Tab 3 Comparison of the relative expression levels of circulated miRNAs in NPand NLPgroups after stratified with WBC level

N和WBC的測量值互相呈顯著強(qiáng)的正相關(guān)（Pearson相關(guān)系數(shù)0.929，P＜0.001），根據(jù)N進(jìn)行分層分析可以得到相似的分層統(tǒng)計(jì)結(jié)果。在早產(chǎn)人群中再根據(jù)CRP升高與否、WBC升高與否以及攜帶支原體與否分別進(jìn)行亞組分析，miR-26b-5p和miR-936水平均無顯著變化（P均＞0.05）。

早產(chǎn)組中調(diào)控失常miRNA的生物信息分析共有266個(gè)基因同時(shí)被數(shù)據(jù)庫miRDB和miRTarBase預(yù)測到是miR-936或miR-26b-5p的靶基因。利用STRING數(shù)據(jù)庫獲得靶基因的互作關(guān)系，并最終獲得前50位關(guān)鍵基因（Hub genes），包括miR-936的靶基因MBNL 1、FGF 2和HIST 1H 2BK，以及miR-26b-5p的靶基因PTEN、EP300及EZH 2等?；蚋患治觯℅ene Enrichment Analysis）結(jié)果顯示，主要富集的靶向通路包括細(xì)胞周期調(diào)控、miRNA調(diào)控、磷脂酰肌醇3-激酶活性的正調(diào)節(jié)及心肌細(xì)胞調(diào)控等方向（圖1）。

圖1 前50位關(guān)鍵靶基因的基因富集分析和互相作用Fig 1 Gene enrichment analysis and gene interaction network of top 50 hub genes

討 論

妊娠子宮提前由靜息表型轉(zhuǎn)為收縮表型是自發(fā)性早產(chǎn)主要臨床特征，它是自發(fā)性早產(chǎn)疾病進(jìn)展的核心器官。本研究首次從子宮平滑肌角度出發(fā)，測定了孕婦血清中子宮平滑肌相關(guān)miRNAs的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)血清miR-936和miR-26b-5p在自發(fā)性早產(chǎn)中異常升高。本文也針對miR-936和miR-26b-5p有實(shí)驗(yàn)室證據(jù)支持的靶基因中尋找關(guān)鍵基因進(jìn)行功能富集和基因本位分析，初步了解了miR-936和miR-26b-5p可能的作用通路。

人類外周血單核細(xì)胞在感染大腸埃希菌或西氏菌屬后表達(dá)高水平的miR-26b-5p分子，miR-26b-5p調(diào)節(jié)了約20%與敗血癥死亡率顯著有關(guān)的關(guān)鍵基因［12，16］；miR-26b-5p也能夠調(diào)控炎癥因子COX2及其合成產(chǎn)物PGE2［17］。在免疫性疾病如銀屑病中，miR-26b-5p在皮下脂肪組織中顯著升高與免疫相關(guān)單核細(xì)胞、纖維細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞中膽固醇代謝的調(diào)控密切相關(guān)［18］。綜上，miR-26b-5p是一個(gè)重要的炎癥和免疫調(diào)控分子。盡管如此，本研究數(shù)據(jù)提示血清miR-26b-5p與早產(chǎn)的關(guān)系獨(dú)立于炎癥。近期國際的臨床研究提示自發(fā)性早產(chǎn)中磷脂代謝異常，有趣的是，我們預(yù)測的miR-26b-5p關(guān)鍵靶點(diǎn)也富集于磷脂代謝調(diào)節(jié)過程，miR-26b-5p是否參與上述過程需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證［19］。

與本文報(bào)道的結(jié)果相反，Wang等［20］發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)中miR-26b-5p異常降低，胎盤中miR-26b-5p下調(diào)是維生素D缺乏導(dǎo)致早產(chǎn)的重要調(diào)控分子。由于本文的研究對象為經(jīng)濟(jì)和營養(yǎng)條件較好的國內(nèi)一線城市患者，維生素D缺乏導(dǎo)致的早產(chǎn)并非主因，并且本研究聚焦于血清而非胎盤，不同的人群和樣本類型可能造成研究間的差異。

目前暫無研究提及miR-936在早產(chǎn)中的作用。miR-936靶向的FGF 2是本文預(yù)測靶基因作用網(wǎng)絡(luò)的熱點(diǎn)基因之一，可以調(diào)控心肌細(xì)胞的增殖及正性調(diào)控細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇3-激酶活性等過程。本研究結(jié)果也提示，miR-936和miR-26b-5p還可能與機(jī)體的細(xì)胞周期調(diào)控和miRNA調(diào)控等功能有關(guān)。盡管如此，miR-26b-5p在組織和血清中的分子作用機(jī)制差異以及miR-26b-5p和miR-936在子宮平滑肌和外周器官的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

目前，受限于研究技術(shù)、分析方法及研究人群，早產(chǎn)血清中表達(dá)失控的miRNAs在不同研究間的異質(zhì)性較強(qiáng)。甚至在2015年，Elovitz等［21］基于該課題組Array技術(shù)篩查結(jié)果認(rèn)為早產(chǎn)患者血清miRNA與未早產(chǎn)者無明顯區(qū)別。但是后來其他科研團(tuán)隊(duì)基于實(shí)時(shí)PCR和RNA測序等技術(shù)，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了與宮頸長度、妊娠時(shí)長、巨大兒以及胎兒性別等有關(guān)的循環(huán)miRNA［8，10，22］。同時(shí)，隨著RNA研究技術(shù)的不斷發(fā)展成熟，不限于循環(huán)中游離的miRNA這一形式，外泌體來源的miRNA、甚至環(huán)狀RNA都被證實(shí)在早產(chǎn)孕婦中呈現(xiàn)特異的表達(dá)譜［23-24］。因此，尋找早產(chǎn)血清中表達(dá)失控RNA分子仍是早產(chǎn)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

本課題探索了可能與早產(chǎn)有關(guān)的多種miRNAs在血清中的表達(dá)，采用穩(wěn)定的Real-time PCR測定法及科學(xué)的血清miRNA內(nèi)參篩選及鑒定法是課題的優(yōu)勢之一。不足在于：本課題為小樣本的探索性研究，限制了差異性統(tǒng)計(jì)分析以及分層分析或亞組分析的把握度，需要在更大規(guī)模的人群中進(jìn)行驗(yàn)證；其次，由于缺乏正常分娩發(fā)動(dòng)產(chǎn)婦作為參照，miR-936和miR-26b-5p與正常產(chǎn)程關(guān)系不能明確；最后，雖然通過生物信息方法預(yù)測了相關(guān)miRNA的功能，后續(xù)需要在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)miR-936和miR-26b-5p的功能及分子機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示血清miR-936和miR-26b-5p水平在早產(chǎn)孕婦中顯著升高，并通過生物信息法初步了解了miR-936和miR-26b-5p可能的生物學(xué)作用，為早產(chǎn)發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的方向。

作者貢獻(xiàn)聲明唐瑤 論文撰寫，實(shí)驗(yàn)分析。龔小會(huì) 標(biāo)本采集，實(shí)驗(yàn)分析，論文修改。劉海燕標(biāo)本采集。顧蔚蓉，李笑天 論文修改，數(shù)據(jù)審核。彭婷 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，論文修改。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。