馬瑞欣 王曉靜 李雪萍 張鵬燕 周凡

摘 要：建立了液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（LC-MS/MS）同位素內(nèi)標(biāo)法同時(shí)檢測(cè)海參中的甲氰菊酯和撲草凈。樣品經(jīng)乙腈提取，濃縮后LC-MS/MS分析，同位素內(nèi)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。結(jié)果表明，甲氰菊酯在0～100 ng/mL、撲草凈在0～50 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均在0.999以上。方法定量限：甲氰菊酯5.0 μg/kg，撲草凈1.0 μg/kg。在5.0～50 μg/kg添加水平下，甲氰菊酯平均回收率在82.4%～102%之間，RSD小于6%;在1.0～50 μg/kg添加水平下，撲草凈平均回收率在104%～115%之間，RSD小于3%。其中甲氰菊酯的回收率明顯優(yōu)于外標(biāo)法，甲氰菊酯和撲草凈的精密度均優(yōu)于外標(biāo)法。

關(guān)鍵詞：同位素內(nèi)標(biāo)法;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）;海參;甲氰菊酯;撲草凈

內(nèi)標(biāo)法是在分析測(cè)定樣品中某組分含量時(shí)，將一個(gè)已知質(zhì)量且樣品中不含有的純物質(zhì)加入至待測(cè)樣品中，以此純物質(zhì)的量為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比測(cè)定待測(cè)組分的含量。加入的純物質(zhì)稱為內(nèi)標(biāo)物。內(nèi)標(biāo)物的種類較多，其中的同位素內(nèi)標(biāo)物因與待測(cè)組分具有相似的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)，可以降低質(zhì)譜檢測(cè)的基質(zhì)效應(yīng)，校正待測(cè)組分在樣品前處理中的損失，因而成為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析中內(nèi)標(biāo)物的首選。本文建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同位素內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)海參中的甲氰菊酯和撲草凈。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-20AD液相色譜儀（日本島津）、QTRAP 4500 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX）、百分之一電子天平（賽多利斯）、平行蒸發(fā)儀（瑞士BUQI）、TDZ5-WS離心機(jī)（湖南湘儀）、MS3渦旋混合器（IKA）、JYS-A8000絞肉機(jī)（九陽(yáng)）。

甲氰菊酯1 000 μg/mL（丙酮）、撲草凈1 000 μg/mL（丙酮）、甲氰菊酯-D5：均為FirstStandard;撲草凈-D6 100 μg/mL（丙酮）：DR。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：取適量甲氰菊酯和撲草凈的標(biāo)準(zhǔn)溶液，氮?dú)獯蹈扇軇┖?，用乙腈定容?00 μg/mL的儲(chǔ)備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋成1 000 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

甲氰菊酯-D5儲(chǔ)備液：用乙腈配制成100 μg/mL的儲(chǔ)備液。

撲草凈-D6儲(chǔ)備液：取適量撲草凈-D6標(biāo)準(zhǔn)溶液，氮?dú)獯蹈扇軇┖?，用乙腈定容?00 μg/mL的儲(chǔ)備液。

混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液：取適量甲氰菊酯-D5儲(chǔ)備液和撲草凈-D6儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋成1 000 ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

乙腈和甲醇（HPLC Grade，Merck）、甲酸（HPLC Grade，DIKMA）、0.2 μm濾膜（PALL），實(shí)驗(yàn)所用水為超純水。

定容溶液：乙腈和水體積比1∶1混合。

1.2 試樣制備

海參去內(nèi)臟后切成小塊后混勻，絞肉機(jī)絞碎，裝入潔凈容器中，密封，-20 ℃保存。

1.3 樣品前處理

稱取5.00 g樣品（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，渦旋混勻1 min，室溫靜置不少于30 min。加入10 mL乙腈，3 000 r/min渦旋混勻2 min，4 000 r/min離心5 min，上清液移入25 mL比色管中;殘?jiān)性偌尤?0 mL乙腈，3 000 r/min渦旋混勻2 min，超聲5 min，4 000 r/min離心5 min，上清液合并至25 mL比色管中，乙腈定容至25.0 mL，混勻備用。

準(zhǔn)確移取5.00 mL提取液45 ℃ 蒸發(fā)至干。準(zhǔn)確加入2.00 mL定容溶液溶解殘?jiān)?，溶液?jīng)0.2 μm濾膜過(guò)濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

液相色譜條件：色譜柱 AccucoreTM? aQ（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），柱溫40 ℃，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，流動(dòng)相A為 0.005 mol/L 乙酸銨溶液（含0.3% 甲酸），B為甲醇;梯度洗脫程序：0～1 min，10%B;1～3 min，10%B～90%B;3～5 min，90%B;5～5.1 min，90%B～10%B;5.1～7 min，10%B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），多反應(yīng)掃描（MRM）正離子模式，噴霧電壓5 500 V，氣簾氣30 PSi， 碰撞氣Medium;溫度550 ℃;霧化氣：55 PSi;輔助加熱氣：55 PSi。質(zhì)譜條件及參數(shù)見(jiàn)表1。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)系列配制

取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液用定容溶液稀釋成0.5、1.0、2.0、5.0、10、25、50、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，其中內(nèi)標(biāo)含量為10.0 ng/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的確定

分別取1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液通過(guò)蠕動(dòng)泵注入質(zhì)譜中，尋找母離子、子離子和碰撞能，并優(yōu)化去簇電壓和碰撞池出口電壓。甲氰菊酯和甲氰菊酯-D5的母離子選擇加NH+4離子m/z 367.1和m/z 372.2，因?yàn)榧覰H+4母離子產(chǎn)生的子離子m/z 125.1產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)且干擾少。

2.2 前處理?xiàng)l件的確定

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中性氧化鋁柱對(duì)甲氰菊酯和撲草凈的凈化作用不明顯，故省去中性氧化鋁柱的凈化步驟[1]。

2.3 線性范圍

以濃度為橫坐標(biāo)，定量離子與內(nèi)標(biāo)物子離子的峰面積比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。甲氰菊酯在0～100 ng/mL、撲草凈在0～50 ng/mL范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，線性系數(shù)r>0.999，見(jiàn)表2。四種物質(zhì)的多反應(yīng)掃描質(zhì)量色譜圖見(jiàn)圖2。

2.4 回收率和精密度

通過(guò)空白樣品添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的方式進(jìn)行回收率和精密度測(cè)試，添加梯度為1.0、5.0、10、50 μg·kg-1，回收率和精密度見(jiàn)表3和表4。由表中數(shù)據(jù)可知，在5.0～50 μg·kg-1添加范圍內(nèi)，甲氰菊酯平均回收率在82.4%～102%之間，RSD在1.89%～5.26%之間;在1.0～50? μg·kg-1添加范圍內(nèi)，撲草凈平均回收率在104%～115%之間，RSD在1.28%～2.71%之間。

2.5 定量限

通過(guò)分析表3和表4中的回收率和RSD值，甲氰菊酯的定量限可定為5.0 μg·kg-1，撲草凈的定量限可定為1.0 μg·kg-1。

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

檢測(cè)實(shí)際樣品38份，檢測(cè)結(jié)果與外標(biāo)法[1]和氣-質(zhì)聯(lián)用法[2-3]一致。

3 結(jié)論

本方法建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同位素內(nèi)標(biāo)法同時(shí)檢測(cè)海參中的甲氰菊酯和撲草凈。前處理操作更加簡(jiǎn)單[2-3]，甲氰菊酯的回收率優(yōu)于外標(biāo)法[1]，甲氰菊酯和撲草凈的精密度均優(yōu)于外標(biāo)法[1]。

參考文獻(xiàn)：

[1] 馬瑞欣，周凡，李雪萍，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定海參中的甲氰菊酯和撲草凈含量[J].河北漁業(yè)，2021（7）：22-24.

[2] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員.動(dòng)物性食品中有機(jī)氯農(nóng)藥和擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥多組分殘留量的測(cè)定：GB/T 5009.162-2008[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009：1-16.

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（收稿日期：2022-02-17）