王珊珊，廖雨昕，喬亮智，杜開峰

(四川大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，四川 成都 610065)

隨著基因工程等生物技術(shù)的不斷發(fā)展，生物產(chǎn)品的生產(chǎn)水平大幅提升，使得胰島素、酶、生長因子、抗體等生物產(chǎn)品的廣泛使用成為可能[1-4]。作為生物產(chǎn)品生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，分離過程占據(jù)總生產(chǎn)成本的60%～90%[5-7]。色譜技術(shù)由于具有分離精度高、分離條件溫和、操作簡單且重復(fù)性高等特點(diǎn)，已成為大規(guī)模生物產(chǎn)品生產(chǎn)過程中使用頻率最高的一項(xiàng)分離純化手段[8-9]。生物分離工程的根本任務(wù)是設(shè)計(jì)和優(yōu)化分離過程，提高分離效率，降低分離成本。因此，作為色譜技術(shù)的核心，高性能色譜介質(zhì)的開發(fā)一直是生物分離工程領(lǐng)域研究的重點(diǎn)[10]。

纖維素是最早應(yīng)用于生物分離的色譜介質(zhì)之一[11]。這主要是因?yàn)槔w維素的基本結(jié)構(gòu)為多糖化合物，表面含有大量羥基[12]，易于修飾功能配基[13]，且非特異性吸附弱，特別適合不穩(wěn)定生物大分子的分離純化[14]。目前，已有系列化的纖維素色譜介質(zhì)產(chǎn)品的上市與應(yīng)用，包括纖維素微球、纖維素膜和纖維素整體柱等，其中，纖維素微球由于出色的流體動力學(xué)特性，且具有可操作性強(qiáng)、易于填充、吸附容量大等優(yōu)勢，是目前生物分離純化領(lǐng)域使用最多的一類色譜介質(zhì)[15]。因此，本文綜述近年來纖維素微球色譜介質(zhì)的研究新進(jìn)展，首先簡述了幾種典型的纖維素微球制備方法及其特點(diǎn)，再著重介紹了孔結(jié)構(gòu)和聚合物配基兩種策略對纖維素微球介質(zhì)色譜性能的強(qiáng)化作用和機(jī)制，以期為進(jìn)一步設(shè)計(jì)構(gòu)建高性能纖維素微球色譜介質(zhì)提供有價值的參考和指導(dǎo)。

1 纖維素微球的制備

目前，纖維素微球的制備方法多種多樣，依據(jù)成形手段的區(qū)別，可分為滴定法[16-20]、噴霧法[21-24]、乳化法[25-32]、微流通道法[33-36]等以及部分特殊制備工藝，如筆者所在課題組開發(fā)的竹纖維一步生成法[37]、Higashi等[38]開發(fā)的微生物發(fā)酵法等。不同的方法所制備得到的微球粒徑、均一性存在很大的區(qū)別(表1)，也影響著纖維素微球介質(zhì)的應(yīng)用領(lǐng)域和范圍。

表1 不同制備方法所制得纖維素微球的主要參數(shù)對比

1.1 滴定法

滴定法是最簡單也是最早報道的纖維素微球制備方法之一。早在1951年，O’Neill等[39]首次報道了采用噴射法以纖維素黃原酸酯為原料制備纖維素微球,整個過程僅需利用注射器或滴管等簡單滴定器具，將纖維素溶液滴入凝固浴中再生便可獲得微球。滴定法所制備出的纖維素微球粒徑大多處于毫米級(表1)，因此其在微球裝填、回收與重復(fù)利用方面具有顯著的優(yōu)勢。Kamal Mohamed等[18]以NaOH/尿素/ZnO的水溶液作為溶劑，在-10 ℃的低溫下溶解纖維素，利用尖端出口直徑約2 mm的細(xì)玻璃滴管將纖維素溶液滴入2 mol/L鹽酸凝固浴中，制備出了2.0～2.5 mm的纖維素凝膠球。滴定法可以通過對滴定距離、纖維素溶液的濃度等參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，從而實(shí)現(xiàn)對纖維素微球形貌、孔徑等參數(shù)的調(diào)節(jié)。Sescousse等[17]將纖維素溶于NaOH溶液，通過改變滴定過程中的多種參數(shù)，利用多通道微量移液器制備纖維素液滴并凝固于水浴中，制備出了各種形狀的纖維素凝膠球，能實(shí)現(xiàn)從圓盤到球形之間的形狀調(diào)控。然而，由于纖維素溶液普遍較高的黏彈性，在滴定過程中與凝固浴液面的撞擊易造成微球拖尾和扁平化現(xiàn)象，球形度較差。此外，在應(yīng)用過程中，微球較大的尺寸也常常導(dǎo)致較低的柱效與分離效率[28]。

1.2 噴霧法

噴霧法本質(zhì)上是一種特殊的滴定法。但相比于滴定法，噴霧法所制備的微球尺寸更小、更均一、更適合批量化生產(chǎn)。谷軍等[23]利用高壓靜電噴霧法，使用微量注射泵推進(jìn)注射器，分別改變纖維素溶液濃度、電壓、推進(jìn)速度和電極間距等參數(shù)，在Na2SO4/H2SO4/H2O凝固浴中再生形成纖維素微球，粒徑可在微米至毫米級之間進(jìn)行可控的調(diào)節(jié)，平均孔徑為100～200 nm。吳偉兵等[24]研究了在不同電壓下的靜電噴霧模式及其對應(yīng)的纖維素微球粒徑分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)電壓在10 kV時，噴射出的液滴狀態(tài)呈現(xiàn)出穩(wěn)定的“Cone-jet”模式，形成的纖維素微球粒徑均一，平均粒徑為111 μm。

1.3 乳化法

乳化法是利用表面活性劑使得纖維素溶液(水相)在油相中被高速剪切力分散成為穩(wěn)定小液滴，再通過再生或交聯(lián)破壞纖維素溶解體系，使纖維素固化得到纖維素微球，是目前使用最為廣泛、工業(yè)化程度最高的纖維素微球制備方法。Liu等[27]以纖維素-離子液體溶液為原料，采用W/O乳化和熱再生相結(jié)合的方法制備出了平均直徑為38 μm多孔纖維素微球。Xiong等[31]利用堿脲體系溶解纖維素和魔芋葡萄多糖并混合均勻，再經(jīng)乳化和鹽酸固化以及一系列后處理之后，最終得粒徑為30～100 μm的再生纖維素微球，所獲纖維素微球粒徑小、耐堿性好、色譜柱效高。Luo等[30]以堿脲體系溶解的纖維素溶液為原料，通過改變表面活性劑的用量、水相與油相的比例以及攪拌速度，控制纖維素微球的平均直徑在5 μm到1 mm之間。然而，由于攪拌分散不能制備尺寸均一的乳液，固化后得到的微球粒徑不均一，在用作色譜介質(zhì)之前，需經(jīng)過反復(fù)篩分，得到粒徑相對均一的微球，這不僅需要額外的分離設(shè)備和加工時間，也導(dǎo)致了原料浪費(fèi)和大量溶劑的使用[37]。

1.4 微流通道法

微流通道法是一種具有新興的纖維素微球制備技術(shù)[40]。微流通道法由于其較小的時空分辨率，可以實(shí)現(xiàn)在微納尺度范圍內(nèi)對液滴的控制，所獲得的纖維素微球粒徑高度均一。童芳麗等[36]以添加Span-85的葵花籽油為油相，以纖維素-離子液體溶液為水相，通過十字形微通道將纖維素溶液剪切分散成粒徑均一的微液滴，滴入水中再生固化成形，所制備的纖維素微球粒徑在100 μm左右。但是該方法產(chǎn)量較低，僅適用于實(shí)驗(yàn)室制備。

1.5 其他方法

上述的制備工藝，無論是滴定法還是乳化法，均需要經(jīng)過溶解、成形和再生3個必不可少的步驟，制備工藝較為繁瑣，且需要大量的試劑和能量消耗。針對這一問題，筆者課題組Du等[37]開發(fā)了一種綠色簡便的制備纖維素微球的新方法(圖1)。利用廉價的木漿竹纖維為基本原料，通過一段時間高碘酸鹽的強(qiáng)氧化作用，直接在高結(jié)晶度的竹纖維表面上自組裝形成多孔纖維素微球。在氧化過程中，高結(jié)晶度的纖維素區(qū)逐漸轉(zhuǎn)化為無定形的纖維素鏈，并且伴隨著雙醛的生成。隨著“腌制”程度的逐漸加深，被氧化的纖維素鏈由于氫鍵作用逐漸聚集并且溶脹，經(jīng)過層層組裝形成微球。該工藝簡單，無需有機(jī)溶劑以及攪拌，是一種有實(shí)際應(yīng)用潛力的纖維素微球制備方法。

圖1 一步生成法構(gòu)建纖維素微球示意及其掃描電子顯微鏡圖像[37]

此外，Higashi等[38]研制了一種微生物發(fā)酵法用于制備細(xì)菌纖維素微球，將木糖駒形氏桿菌(Komagataeibacterxylinus，NBRC 13693)與明膠在低溫下混合，利用微流通道法制備細(xì)菌/明膠微球，然后促使細(xì)菌微球內(nèi)部發(fā)酵合成細(xì)菌纖維素，最終可獲得最小球徑約為10 μm的細(xì)菌纖維素微球。

2 纖維素微球的孔結(jié)構(gòu)調(diào)控

纖維素微球孔結(jié)構(gòu)對其色譜分離性能有著決定性的影響。因此，為了提高纖維素微球的色譜性能，開發(fā)出有效的纖維素微球結(jié)構(gòu)調(diào)控策略、加快傳質(zhì)速率、同時提高吸附容量成為目前纖維素微球色譜介質(zhì)研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。筆者所在課題組在纖維素微球的結(jié)構(gòu)調(diào)控方面也進(jìn)行了大量的研究與探索，基于傳統(tǒng)的乳化法，開發(fā)了多種孔調(diào)控策略，如預(yù)交聯(lián)法[28-29]、模板法[26]、雙乳化法[25]和表面活性劑膠團(tuán)溶脹法[41]等，顯著提升了纖維素微球色譜性能。

2.1 預(yù)交聯(lián)法

比表面積大意味著微球可以接枝更多數(shù)量的配基，具有更高的吸附容量。Qiao等[28]通過預(yù)交聯(lián)法(PCC)成功制備了一種具有比表面積大的多孔纖維素微球(DEAE-Cb/PCC)(圖2)。該方法的關(guān)鍵在于將纖維素溶液與交聯(lián)劑預(yù)混合，使交聯(lián)劑均勻地分散在纖維素液滴內(nèi)，促進(jìn)交聯(lián)反應(yīng)在整個微球中均勻發(fā)生，從而有效提高微球強(qiáng)度并降低結(jié)晶度。交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生破壞了纖維素晶體的正常生長，產(chǎn)生了更多的非晶區(qū)，從而有效增大了微球的比表面積，比表面積達(dá)到約142.96 m2/g，約為傳統(tǒng)纖維素微球的3倍。此外，這種PCC策略也有效地提升了微球的力學(xué)強(qiáng)度。進(jìn)一步采用二乙基氯乙烷鹽酸鹽(DEAE)改性后，獲得的吸附劑對牛血清白蛋白(BSA)和對牛血紅蛋白(BHb)的吸附容量分別達(dá)到204.58和144.78 mg/g，遠(yuǎn)高于過去文獻(xiàn)所報道的以及商業(yè)瓊脂糖微球(DEAE-FF)吸附劑(表2)。

圖2 預(yù)交聯(lián)策略構(gòu)建纖維素微球示意及其形貌[28]

表2 不同纖維素微球的主要參數(shù)及吸附性能對比

2.2 模板法

模板法通過簡單的模板混合與去除即可得到相應(yīng)的孔道。通過選擇或合成相應(yīng)的模板，可以實(shí)現(xiàn)微納孔道結(jié)構(gòu)，包括孔形、孔徑及孔分布的準(zhǔn)確控制。Qiao等[26]研究以瓊脂糖為介/微孔模板，采用乳化法制備了一種比表面積大的大孔纖維素納米纖維微球DEAE-NCM-20(圖3)。制孔機(jī)制為①瓊脂糖和纖維素都可以溶于堿/脲溶液，使兩者可以充分地混合；②利用瓊脂糖熱溶性質(zhì)，通過沸水浴將瓊脂糖模板去除。微球比表面積最大達(dá)到173.85 m2/g，孔徑達(dá)到0.5～1.0 μm。進(jìn)一步經(jīng)DEAE改性后，對BSA的最大吸附量達(dá)到409.46 mg/g。因?yàn)橄嗷ミB通的大孔結(jié)構(gòu)顯著降低了吸附阻力，提升了吸附速率，最終效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過商用DEAE-FF介質(zhì)(51.30 mg/g)(表2)。

圖3 DEAE-NCM-20的制備示意及其形貌[26]

2.3 雙乳化法

除比表面積外，微球的孔徑也對其色譜分離效率有著非常重要的影響。特別是對于生物大分子這類分子尺寸較大的物質(zhì)，較小的孔徑易造成孔道堵塞，導(dǎo)致吸附容量過小，微球吸附位點(diǎn)利用率降低等問題。而且生物大分子不穩(wěn)定，長時間操作易導(dǎo)致產(chǎn)物失活，所以擴(kuò)展微球孔徑成為解決該問題的一條有效途徑。這主要是由于大尺寸孔道有利于生物大分子在孔內(nèi)的傳質(zhì)，提高了微/介孔的可及性，不僅可提升傳質(zhì)能力，也可增大吸附容量。Du等[25]采用雙乳化法成功制備出一種具有雙孔結(jié)構(gòu)的球形纖維素吸附劑(MCB)，具有10～20 nm的擴(kuò)散孔和800～2 000 nm的大孔。通過調(diào)節(jié)有機(jī)相、表面活性劑的組成和比例，促使表面活性劑與纖維素溶液形成互相穿透的雙連續(xù)相，進(jìn)一步再生，得到具有雙孔結(jié)構(gòu)的纖維素微球。將微球進(jìn)行交聯(lián)并利用DEAE改性獲得陰離子色譜介質(zhì)。經(jīng)測試發(fā)現(xiàn)，相比于微孔纖維素微球(HCB)，MCB微球具有更低的柱壓，吸附容量也超過HCB和商業(yè)瓊脂糖微球(CSFF)，實(shí)現(xiàn)了對蛋白質(zhì)的高容量和快速分離。

2.4 表面活性劑膠束溶脹法

當(dāng)表面活性劑在溶液中的濃度超過其臨界膠束濃度時，表面活性劑會形成膠束或反膠束。利用這一特點(diǎn)，Qiao等[41]采用表面活性劑膠束溶脹制備大孔纖維素/碳納米管微球(LMCMs)(圖4),將高濃度表面活性劑加入纖維素/碳納米管水溶液形成表面活性劑膠束，再進(jìn)行乳化。在乳化過程中，表面活性劑的疏水內(nèi)核將外部油相吸收到液滴中形成油相通道，再生凝固后，這些油相通道轉(zhuǎn)化為大孔，孔徑約達(dá)到5 μm，比表面積162.39 m2/g。以此對膽紅素進(jìn)行吸附，該吸附劑在2 h內(nèi)的吸附量(314.14 mg/g)即達(dá)到最大吸附量(338.14 mg/g)的92.9%，遠(yuǎn)超過未制孔纖維素/碳納米管微球(LCMs)的194.23 mg/g。

圖4 大孔纖維素/碳納米管微球制備示意及其形貌[41]

3 聚合物接枝改性

配基接枝是制備纖維素基吸附劑的重要后處理步驟[56]，通過對纖維素基材表面進(jìn)行化學(xué)改性，連接新的化學(xué)功能基團(tuán)，賦予其對生物大分子特異性吸附的能力。近年來，聚合物接枝修飾得到了產(chǎn)學(xué)界的廣泛關(guān)注。相較于傳統(tǒng)的短鏈配基，聚合物接枝配基通常擁有更高的吸附容量和吸附速率。高吸附容量歸功于聚合物配基提供的三維吸附空間，可以更加靈活地與生物大分子結(jié)合；快吸附速率則是因?yàn)榫酆衔锱浠梢源龠M(jìn)生物大分子的表面擴(kuò)散。Yao等[57]通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合將間二甲苯二磷酸鹽固定在多孔纖維素整體柱表面(圖5)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種觸須狀配基對溶菌酶的最大靜態(tài)和動態(tài)吸附容量分別達(dá)到169.6 mg/mL和102.6 mg/mL。此外，He等[58]以乙烯基膦酸(VPA)為單體，通過自由基聚合方法成功合成了一種聚合物接枝型的磷酸基棉纖維基材料CF-NH2-AZO-p(VPA-x)，經(jīng)鈦離子進(jìn)一步固定化后得到一種金屬親和層析介質(zhì)，該介質(zhì)可以從大鼠腦溶解液中分離出8 107個獨(dú)特的磷酸肽和9 381個磷酸酯。Wang等[42]在大孔再生纖維素膜上利用光引發(fā)的多相接枝共聚法制備了聚(丙烯酸-亞甲基雙丙烯酰胺)接枝的纖維素吸附劑，對溶菌酶和γ-球蛋白的最大靜態(tài)吸附量分別達(dá)到89.5和66.0 mg/mL，表現(xiàn)出比短鏈配基更高的吸附容量(表2)。

圖5 觸手狀聚合物接枝示意[57]

4 結(jié)語

通過對纖維素微球的制備方法、孔結(jié)構(gòu)調(diào)控和聚合物配基接枝的系統(tǒng)介紹，闡述了不同方法對纖維素微球形貌及色譜性能的影響及作用機(jī)制。這些也為今后高性能色譜介質(zhì)的制備提供了可參考的研究思路和方向。例如，針對不同應(yīng)用領(lǐng)域?qū)ξ⑶蛄匠叽绲囊蟛煌梢赃x用合適的制備方法來生產(chǎn)所需微球；比表面積大益于吸附容量的提升，而大孔結(jié)構(gòu)有利于提升生物分子在孔內(nèi)的傳質(zhì)，提高吸附速率；此外，聚合物配基也為生物大分子吸附容量和速率提升提供了一條有效途徑。盡管纖維素微球色譜介質(zhì)高能化研究已經(jīng)取得了長足的進(jìn)展，但在面向應(yīng)用過程中仍有兩個重要科學(xué)問題需深入研究：一是大規(guī)模制備尺寸均一的微球。目前常用手段仍是分級篩分，不僅效率低，而且過程繁瑣，微球和溶劑浪費(fèi)嚴(yán)重；二是纖維素微球的孔結(jié)構(gòu)化學(xué)性質(zhì)對其生物分離性能的影響機(jī)制。這里孔的結(jié)構(gòu)化學(xué)性質(zhì)包括兩層含義：一是孔的物理性質(zhì)，包括孔尺寸、形貌和分布；二是孔表面化學(xué)性質(zhì)，主要受表面配基影響。由于生物分子較大的尺寸和復(fù)雜的表面性質(zhì)，相比于小分子吸附分離，生物分子的吸附過程十分復(fù)雜，相關(guān)研究結(jié)果可為纖維素微球色譜介質(zhì)的構(gòu)建和應(yīng)用提供有價值的思路和指導(dǎo)。