陳 雪，安 英，沈 楠，徐 博，趙麗晶

（吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院·吉林吉林·132013）

肉蓯蓉為列當(dāng)科植物蓯蓉或管花肉蓯蓉的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，藥用價值極高，在歷代增力配方中使用頻率居首位，在滋補、抗衰老延年類配方中居第位，僅次于人參。肉蓯蓉作為兩千年來使用頻率最高的補腎壯陽中藥，被美譽為“沙漠人參”，具有補腎壯陽，益精血、潤腸通便、延緩衰老等療效。研究發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉可促進幼齡小鼠及大鼠睪丸生長發(fā)育，增加精囊前列腺的質(zhì)量，證明其具有促激素樣作用。對幼年去勢大鼠，無論是生品還是炮制品，均可明顯增加副性器官的質(zhì)量，同樣顯示了雄激素樣作用。近年來，國內(nèi)外對肉蓯蓉的化學(xué)成分進行了許多分析研究，已分離出多種類型的物質(zhì)，如苯乙醇苷類、環(huán)烯醚帖類、揮發(fā)性成分、木質(zhì)素類、多糖、生物堿等［1-3］。

毛蕊花糖苷(Acteoside，ACT)為苯乙醇苷類(phenylethanoid glycoside，PhG)化合物，是植物界中該類的代表性化合物，藥理學(xué)研究證明，ACT具有廣泛的藥理作用，包括抗氧化、保護神經(jīng)、改善學(xué)習(xí)記憶、抗炎、抗腫瘤、保護肝臟以及免疫調(diào)節(jié)等作用［4-8］。國內(nèi)外有關(guān)毛蕊花糖苷在改善生精功能障礙、促進精子成熟領(lǐng)域的研究報道較少，尚缺乏系統(tǒng)深入的研究，本研究主要通過體外實驗揭示毛蕊花糖苷對氧化損傷睪丸間質(zhì)細(xì)胞保護作用。

1 材料和方法

1.1 TM3細(xì)胞株

TM3細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 試劑

毛蕊花糖苷由維克奇生物科技有限公司提供；胎牛血清(Fetalbovineserum)、DMEM-F12、胰蛋白酶(tyrsin)，Gibeo公司；青霉素鈉(penicillin)、硫酸鏈霉素(streptomycin)，西安制藥公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、DMSO，美國Sigma公司；Trypsin、EDTA，Amresco公司。

1.3 儀器設(shè)備

CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(SHELL/JB型)，美國Sartorius公司；全自動高壓消毒鍋（SM-51），日本Yamato公司；倒置相差顯微鏡，日本OlymPuS公司；超凈工作室(FLB-lB型)，蘇州蘇靜集團；-80℃低溫冰箱，美國Revco公司；高速低溫離心機(型號JZ-CM)，美國BECKMAN公司；Milli-Q、Synthesis超純水系統(tǒng)，美國Millipore。

1.4 實驗方法

1.4.1 睪丸間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代

從-80℃取出凍存的TM3細(xì)胞株，在37℃水浴融化后，迅速移至超凈工作臺上復(fù)蘇，將其用移液槍加入含10%血清的F12培養(yǎng)液中，以1∶2的比例傳代，在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日觀察細(xì)胞狀態(tài)，用于后續(xù)試驗。

1.4.2 細(xì)胞計數(shù)

1.4.2.1 細(xì)胞的傳代

經(jīng)步驟1.4.1培養(yǎng)的TM3細(xì)胞貼壁后，進行傳代。在超凈臺中，打開酒精燈，在酒精燈周圍打開瓶蓋，瓶蓋過火滅菌，倒掉原有培養(yǎng)基，PBS清洗3次，用移液槍吸取消化液加入瓶中，平鋪瓶內(nèi)，使消化液完全覆蓋住瓶壁上的TM3細(xì)胞。一邊晃動培養(yǎng)瓶一邊觀察，當(dāng)瓶內(nèi)細(xì)胞大塊滑落，立即用移液槍取2mL含10%血清的F12培養(yǎng)液加入瓶內(nèi)，終止消化。移液槍從瓶內(nèi)一側(cè)吹打細(xì)胞，形成單個細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液移至無菌的離心管中，封口膜封好瓶口。將離心管對稱放入離心機中1000rpm速度離心4min。離心后，棄上清，移液器吸出新的培養(yǎng)基加入管中與沉淀混合，再將懸液平均分到2個培養(yǎng)瓶中。

1.4.2.2 TM3細(xì)胞的分組

將細(xì)胞分為正常組、過氧化氫模型組、毛蕊花糖苷低劑量組（25μg/ml）、中劑量組（50μg/ml）、髙劑量組（100μg/ml）共5瓶細(xì)胞，在模型組、毛蕊花糖苷低、中、高劑量組加入400μmol/L過氧化氫作用4h后，分別加入相應(yīng)濃度為25、50、100μg/ml的藥物作用24h，備用。

1.4.2.3 MTT法檢測細(xì)胞活性

TM3細(xì)胞長至約80%左右，消化細(xì)胞，進行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量。在無菌的96孔板中接種細(xì)胞（106個細(xì)胞/孔），培養(yǎng)過夜。按1.4.2.2步驟進行細(xì)胞的分組，每組設(shè)5個復(fù)孔，加入5mg/ml四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)溶液20μl/孔培養(yǎng)4h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加人200μl DMSO室溫振蕩10min，在酶標(biāo)儀上以490nm波長測定各孔吸光度(A值)，記錄結(jié)果，實驗重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

顯微鏡下可見：細(xì)胞培養(yǎng)24h后，貼壁的TM3細(xì)胞大部分都伸展出偽足，呈三角形，細(xì)胞生長密集且數(shù)量多，如圖1所示（正常組）；經(jīng)400μmol/L過氧化氫損傷后的模型組細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞體積變小并且數(shù)量明顯減少，折光弱；隨著毛蕊花糖苷給藥劑量的增加，細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，尤其是毛蕊花糖苷高劑量組細(xì)胞基本恢復(fù)正常。

圖1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

2.2 毛蕊花糖苷對TM3細(xì)胞生長的影響

以25、50、100μg/ml的毛蕊花糖苷F12培養(yǎng)液處理氧化損傷后TM3細(xì)胞24小時后，各組細(xì)胞存活率詳見圖2。

圖2 毛蕊花糖苷對TM3細(xì)胞生長的影響

隨著毛蕊花糖苷濃度的增加，吸光度(A值)略有增高，其中毛蕊花糖苷中劑量組和毛蕊花糖苷高劑量組與模型組比較，差異顯著（P＜0.05）。

3 結(jié)論

通過體外培養(yǎng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞（TM3），在培養(yǎng)環(huán)境中加入H2O2制備TM3氧化應(yīng)激損傷模型，并檢測毛蕊花糖苷對TM3氧化應(yīng)激損傷后作用。結(jié)果顯示，毛蕊花糖苷對培養(yǎng)的TM3細(xì)胞無毒性作用，25、50、100μg/ml毛蕊花糖苷對細(xì)胞的生長無明顯抑制作用，而且還具有一定的促進增殖趨勢。25、50、100μg/ml毛蕊花糖苷對氧化損傷具有明顯的保護作用，且呈濃度依賴。

4 結(jié)語

隨著時代的發(fā)展，人們比起以前更加關(guān)注自身的健康狀況，不孕不育這一重要問題也日益被人所關(guān)注，發(fā)病率趨勢逐年增加，其發(fā)病原因、影響因素已成為全球性生殖醫(yī)學(xué)的研究熱點。

男性不育癥的病因很多，目前已經(jīng)明確許多因素與男性不育癥明顯相關(guān)，如性腺功能低下、精索靜脈曲張、感染、免疫性不育、輸精管梗阻所致不育、隱睪癥等[9-10]，應(yīng)用針對病因的藥物或者手術(shù)治療可以取得比較滿意的治療效果，男科醫(yī)生在這些方面的治療已經(jīng)積累了不少經(jīng)驗。但是仍有相當(dāng)一部分男性不育癥的病因不明，目前現(xiàn)有的技術(shù)手段不能找出病因的不育癥，即特發(fā)性男性不育癥，約占男性不育癥的31.6%[11-12]，對這類不育癥的治療目前只是經(jīng)驗性的，而且療效不確定，治療機制也多不明了，從而給西醫(yī)治療帶來了難度。

睪丸間質(zhì)細(xì)胞是睪丸中一種能特異性產(chǎn)生男性雄激素的細(xì)胞，這對男性的生育能力和精子發(fā)生的維護至關(guān)重要，本研究結(jié)果為男性不育的藥物治療提供了新思路,為研究毛蕊花糖苷的生精作用研究奠定了基礎(chǔ)。