張騰帥，張艷英，劉京國

（1農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2河北科技師范學(xué)院動物科技學(xué)院，河北 秦皇島 066600；3河北省動物疫病預(yù)防控制中心，石家莊 050035）

0 引言

宿主和腸道微生物之間存在互利共生的關(guān)系，一方面，腸道微生物對宿主的營養(yǎng)、代謝、發(fā)育有促進(jìn)作用，另一方面，腸道微生物也會為宿主帶來各種致病菌[1-2]。雞的腸道微生物還會影響雞的產(chǎn)量[3-4]。雞腸道微生物的組成受宿主因素，如品種、雞齡、發(fā)育情況，和飼養(yǎng)管理，如飼養(yǎng)環(huán)境、飼料與飼料添加劑、健康干預(yù)等影響。有文獻(xiàn)報道，1日齡的雞腸道中已經(jīng)有微生物存在[5-6]，但是，幼雞腸道微生物組成變化很大[7-8]。因此，一般用至少20周齡的雞來研究其腸道微生物組成。

高密度飼養(yǎng)雞需要嚴(yán)格控制溫度和濕度。即使這樣，當(dāng)外部氣候條件發(fā)生改變時，如酷熱天氣，也會對雞的健康和生產(chǎn)造成負(fù)面影響[9-10]。當(dāng)環(huán)境溫度較高時，可導(dǎo)致雞小腸絨毛局部區(qū)域水腫、斷裂，絨毛受到影響會嚴(yán)重減少。較典型的例子就是熱應(yīng)激可以降低家禽的腸道黏膜絨毛高度，而腸絨毛高度降低會導(dǎo)致表面積減少，從而影響腸道吸收與免疫功能，進(jìn)而引發(fā)腸道內(nèi)環(huán)境菌群平衡的失調(diào)[11]。持續(xù)偏熱環(huán)境還可以降低盲腸細(xì)菌的總含量和腸道微生物的多樣性，增加了致病菌的定植，從而降低了機(jī)體應(yīng)對不良因素的能力[12]。對美國佐治亞州的商品肉雞檢測發(fā)現(xiàn)，雞盲腸內(nèi)微生物群落受季節(jié)變化影響較大。冬季盲腸內(nèi)微生物的數(shù)量明顯小于春季或夏季，而影響腸道健康的微生物在秋季明顯減少[13]。類似的季節(jié)影響微生物群落的現(xiàn)象在青蛙中也存在[14]。

目前，中國對雞腸道菌群的研究主要集中在日糧、抗生素、益生菌[15-16]等方面，季節(jié)環(huán)境條件對雞腸道菌群影響還未見報道，更沒有對提倡生態(tài)養(yǎng)殖的林下散養(yǎng)雞腸道微生物影響的報道。盲腸因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)而具有豐富、多樣和相對穩(wěn)定的微生物菌群[17]，小腸是雞腸道最主要的營養(yǎng)吸收部位，因此，本研究以林下散養(yǎng)蘆花雞的盲腸和小腸為研究對象，采用變性梯度凝膠電泳法分析季節(jié)對其腸道微生物群落的影響，以期能為散養(yǎng)雞的養(yǎng)殖提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

蘆花雞（7—8月齡）由北京農(nóng)學(xué)院實(shí)踐基地散養(yǎng)。飼養(yǎng)過程中，未使用過抗生素等藥物，食物主要為自給。在冬季（1月下旬左右）、春季（4個月下旬左右）和夏季（7月下旬左右），分別選取4只成年蘆花雞（公母各一半），采用喉嚨放血的方法處死蘆花雞，打開腹腔，用線繩把盲腸和小腸中間段的兩端結(jié)扎，在超凈工作臺內(nèi)將同一季節(jié)的盲腸或小腸內(nèi)容物分別取出、混勻后，分裝于2 mL無菌離心管，-80℃保存。

1.2 腸道微生物16S rDNAV3區(qū)的擴(kuò)增

采用CTAB法提取雞腸道菌群基因組DNA。依據(jù)參考文獻(xiàn)[18]，設(shè)計(jì)出16S rDNA V3區(qū)特異引物（表1）。以雞腸道菌群基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：10×緩沖液5 μL（含Mg2+），dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，引物(GC357F/517R;10 μM)1.0 μL，模板 DNA 1.0 μL，pfu DNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，用ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。采用全式金公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit對PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。

表1 引物信息

1.3 變性梯度凝膠電泳及條帶克隆測序

選用8%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行DNA分離，以去離子甲酰胺與尿素作為變性劑，變性劑濃度梯度從上到下30% ～65%。凝膠先在1×TAE緩沖液下進(jìn)行1 h預(yù)電泳，使電泳液加熱至60℃。取10 μL PCR擴(kuò)增片段上樣，150 V電泳10 h。電泳完畢后用去離子水洗2次，硝酸銀染色，Bio-Rad公司凝膠成像系統(tǒng)掃描照膠。

將凝膠上的共性條帶與差異條帶分別切下，用無菌水清洗后1 ～2次后放入1.5 mL離心管，加入50 μL 1×TE緩沖液，于暗處4℃過夜析出DNA。取2 μL析出液為模板，按上述方法再次擴(kuò)增16S rDNAV3區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后，用DGGE電泳確定回收片段正確性。若正確，再取1 μL析出液為模板，以357F/517R為模板，按上述方法進(jìn)行16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用EasyPure Quick Gel Extraction Kit進(jìn)行膠回收純化。純化產(chǎn)物連接到pEASY-T1載體上。陽性克隆經(jīng)PCR檢驗(yàn)正確后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

DGGE凝膠染色后用Quantity One軟件(Bio-Rad,USA)進(jìn)行條帶識別與灰度值分析。用UPGMA(unweighted pair group mean average)進(jìn)行數(shù)據(jù)聚類分析。測序結(jié)果在NCBI的Blask中進(jìn)行比對分析，樣品的多樣性用香濃指數(shù)(H)、均勻度(E)和豐富度(R)指標(biāo)表示[12]。其中H和E的計(jì)算見公式(1)和公式(2)。

式中，pi為凝膠上單一條帶的灰度值在該凝膠上所有條帶總灰度值中所占的比率，N為DGGE圖譜單一泳道上所有條帶的豐度，Ni為第i條帶的豐度；S是某樣品中所有條帶數(shù)目總和。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同季節(jié)蘆花雞腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

從DGGE圖譜（圖1）中可以看出，盲腸、小腸菌群在不同季節(jié)的結(jié)構(gòu)均存在差異。以冬季群落結(jié)構(gòu)為100%，盲腸菌群的相似系數(shù)在春季、夏季時分別為82.3%、66.7%；小腸菌群的相似系數(shù)在春季、夏季時分別為77.8%、62.5%（表2）。這表明，盲腸和小腸的菌群結(jié)構(gòu)都是在冬季和夏季時差異最大。季節(jié)對盲腸或小腸菌群的DGGE圖譜條帶數(shù)影響不大，但小腸菌群對應(yīng)條帶數(shù)比盲腸菌群明顯較少，這說明小腸菌群的豐富度要明顯低于盲腸。

圖1 不同季節(jié)雞盲腸(A)和小腸(B)菌群DGGE圖譜

表2 雞腸道菌群多樣性指數(shù)

冬季、春季、夏季盲腸菌群的均勻度分別為0.95，0.94，0.96，整體變化不大；小腸菌群在冬季、春季、夏季的均勻度分別為0.89，0.80，0.89，相對盲腸而言整體較低，且春季時只有0.80。盲腸菌群在冬季、春季、夏季的香濃指數(shù)分別為3.02、3.49、3.19；小腸菌群在冬季、春季、夏季的香濃指數(shù)分別為2.82、2.07、2.49（表2）。這表明，隨季節(jié)變化盲腸、小腸菌群的多樣性呈現(xiàn)不同變化，其中盲腸菌群在春季時多樣性最高，而小腸菌群在春季時多樣性最低。

2.2 不同季節(jié)蘆花雞腸道共性菌群與特異菌群分析

從盲腸菌群DGGE圖譜上共回收了11個條帶，其中共性條帶6條（圖1A中編號1-3，6-8），特異性條帶5條（圖1A中編號4，5，9，10，11）。共性條帶為盲腸內(nèi)的主要優(yōu)勢菌種，主要為巨單胞菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬等（表3），它們的數(shù)量沒有隨季節(jié)改變而明顯變化。特異性條帶只在單一季節(jié)出現(xiàn)，其中冬季特異微生物為Paraclostridium benzoelyticum，夏季特異微生物為Colidextribacter massiliensis，而春季特異微生物為Lactobacillus johnsonii和L.amylovorus。

表3 DGGE圖譜中條帶的基因片段序列比對

從小腸菌群DGGE圖譜上共分回收了8個條帶，其中共性條帶5條（圖1B中編號a-e），特異性條帶3條（圖1B中編號f-h）。共性條帶為小腸內(nèi)的乳酸菌屬和梭菌屬（表3），它們的數(shù)量大都會隨季節(jié)變化而變化。在3條特異性條帶中，f為Uncultured bacterium，只存在冬季和春季小腸中；g和h為P.benzoelyticum，只存在夏季小腸中。

3 討論

3.1 不依賴培養(yǎng)的微生物菌群分析方法比較

一直以來，人類采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)的方法研究腸道微生物。但是，這種方法具有高度的選擇性，只能分離不到1%的可培養(yǎng)微生物[19-20]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，先后出現(xiàn)DNA指紋圖譜技術(shù)，如變性梯度凝膠電泳(DGGE)和單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)，DNA芯片技術(shù)，高通量測序技術(shù)(HTS)。這些技術(shù)可以檢測到那些不可培養(yǎng)的微生物[21-22]。其中DGGE和HTS技術(shù)在研究腸道微生物中應(yīng)用比較廣泛。DGGE的優(yōu)勢是可以用電泳圖片直觀地顯示樣本之間的差異，而且根據(jù)不同的目的設(shè)計(jì)不同的引物，還可以回收克隆目標(biāo)條帶。但是相對HTS技術(shù)而言，DGGE技術(shù)檢測低豐度的微生物的能力較低[21-22]。夏圍圍等用實(shí)驗(yàn)證明，相對高通量測序結(jié)果，DGGE明顯高估了土壤中大多數(shù)微生物類群的相對豐度，而低估了多樣性指數(shù)的絕對值[23]。但是由于這兩個技術(shù)各有優(yōu)勢，當(dāng)前很多工作同時采用兩種方法檢測微生物群落變化[24-25]。

3.2 不同季節(jié)雞腸道微生物菌群的比較

為更貼近現(xiàn)實(shí)地探討了季節(jié)變化對雞腸道菌群的影響，本實(shí)驗(yàn)選取的是林下散養(yǎng)成年蘆花雞（未使用過抗生素等藥物，食物主要為自給），用DGGE的方法研究季節(jié)環(huán)境改變對雞腸道菌群的影響。研究發(fā)現(xiàn)盲腸與小腸菌群隨季節(jié)變化呈現(xiàn)截然相反的變化規(guī)律。盲腸菌群多樣性春季時最高，夏季次之，冬季最低。這一變化規(guī)律與以前的報道類似。彭騫騫等[12]用DGGE方法證明，持續(xù)偏熱環(huán)境可以降低盲腸微生物的多樣性，26℃與31℃均降低了雞盲腸菌群含量，減少了盲腸菌群多樣性。Oakley等[13]用高通量測序方法研究也表明，冬季商品化肉雞盲腸內(nèi)微生物的數(shù)量明顯小于春季或夏季。這可能是因?yàn)檫^冷或過熱會導(dǎo)致家禽腸道黏膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變所致[26]。但是，散養(yǎng)蘆花雞小腸內(nèi)菌群的多樣性在春季時最低，在冬季、夏季時會增高（表2）。這可能因?yàn)榧竟?jié)的變化會影響到雞的代謝活動，從而進(jìn)一步影響菌群在小腸內(nèi)停留或定植的時間[13]。除了季節(jié)影響雞腸道微生物的變化外，有文獻(xiàn)報道，地域的不同也會造成雞腸道微生物菌群的差異[27-28]。

本文在研究季節(jié)變化對雞盲腸和小腸微生物菌群結(jié)構(gòu)變化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析了不同季節(jié)的優(yōu)勢菌。結(jié)果表明，盲腸中的優(yōu)勢菌包括巨單胞菌屬、擬桿菌屬和梭菌屬等。季節(jié)改變對盲腸共性菌株沒有顯著性影響，但對特異菌株有影響。冬季雞盲腸中P.benzoelyticum會增多；夏季C.massiliensi（s一種產(chǎn)生的毒素能在宿主細(xì)胞上形成孔道的致病菌[29]）和E.coprostanoligenes會增多，而春季乳酸菌屬會增多。小腸中的優(yōu)勢菌包括乳酸菌屬和梭菌屬。很多實(shí)驗(yàn)已表明，乳酸菌對雞的生長、免疫系統(tǒng)和腸道微生物都有積極的影響[30-31]。而小腸內(nèi)的優(yōu)勢梭菌屬則是能分泌膽酸抑制致病菌的C.hiranonis[32]。與盲腸不同的是，季節(jié)改變既能影響小腸內(nèi)共性菌株的相對比例（圖1B中相同水平位置上帶的亮度不同），又能影響特異菌株的含量，如夏季小腸內(nèi)P.benzoelyticum和C.hiranonis會大量繁殖。這些結(jié)果對于利用腸道菌資源、開發(fā)新型微生態(tài)制劑，進(jìn)而改善腸道菌群并提高生產(chǎn)性能，有著極其重要的理論意義和應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本研究通過實(shí)驗(yàn)證明，季節(jié)對散養(yǎng)蘆花雞腸道菌群的多樣性和結(jié)構(gòu)有很大影響。盲腸菌群多樣性春季時最高，夏季次之，冬季最低；而小腸腸道菌群正好相反。盲腸菌群要比小腸復(fù)雜。季節(jié)對盲腸和小腸中的優(yōu)勢共生菌影響不大，但雞盲腸中冬季P.benzoelyticum會增多，夏季C.massiliensis和E.coprostanoligenes會增多，而春季乳酸菌屬會增多。