吳佳佳，朱佳紅，曹坳程，顏冬冬，王秋霞，張春華，李 園

（1農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥化學(xué)與應(yīng)用重點開放實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，北京 100193；2福貢縣農(nóng)業(yè)局，植保植檢站，云南怒江 673499）

0 引言

草果在中國西南地區(qū)（云南，貴州，廣西）和越南北部及亞洲其他地區(qū)廣泛種植[1]。云南省是草果的主要產(chǎn)區(qū)，其產(chǎn)量和種植面積約占中國的95%[2]。據(jù)2016年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，云南草果的種植面積為22.93萬hm2，其中紅河州為6.93萬hm2[3]。先前的研究表明，草果精油對病原體具有不同程度的抑制作用[4-6]，可作為中藥材和香料，具有商業(yè)價值，已成為當?shù)卮迕褡钪匾氖杖雭碓粗籟7-8]，近幾年栽培規(guī)模擴增明顯，已成為云南省福貢縣的支柱產(chǎn)業(yè)。提高草果的產(chǎn)量和質(zhì)量對于增加農(nóng)民的收入和增加中國中藥的出口已經(jīng)變得非常重要。因此，及時科學(xué)診斷病害并提出具體的防治藥劑，對于提高草果產(chǎn)量和品質(zhì)具有十分重要的現(xiàn)實意義。

由于常年連作，土傳病害嚴重，影響了草果的產(chǎn)量和品質(zhì)[9]。Guo等[10]報道稱，在云南屏邊縣，草果出現(xiàn)了黑斑病癥狀。對于草果產(chǎn)業(yè)來說，土傳病害是巨大的挑戰(zhàn)。草果的生長環(huán)境溫暖濕潤，這也為病原菌提供了良好的繁殖環(huán)境。草果真菌病害種類多、分布廣、危害大，各種病害從癥狀上難以區(qū)分，導(dǎo)致防治困難。常見的草果病害包括枯萎病，葉斑病和炭疽病，近年來，隨著草果種植面積的擴大，草果真菌病害的發(fā)生呈上升趨勢，且多種病害復(fù)合發(fā)生，已成為限制草果產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的問題[11-12]。因此，確定草果主要病害的致病菌，篩選出有效的化學(xué)防治藥劑，對促進草果產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

為了明確引起草果致病菌種類以及有效的防治藥劑，本研究從云南省福貢縣采集草果病株，對分離得到的菌株進行形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定。確定分離到的菌株為禾谷鐮刀菌和膠孢炭疽菌，為首次在草果中分離得到。同時使用了7種常用的殺菌劑，以評估對分離出的病原菌的抑制效果，從而找到合適的殺菌劑用于田間病害防治，減少由草果病害引起的經(jīng)濟損失。

1 材料與方法

1.1 病樣采集與防治藥劑

2019年5月15日，對中國云南省福貢縣草果進行了田間調(diào)查，發(fā)現(xiàn)大約40%的植株出現(xiàn)了病害，并采集了35份具有不同典型、明顯病癥的草果葉片、莖稈和根的病害樣本和25份健康樣本帶回實驗室，用清水將其沖洗并晾干，分別進行了病組織病原菌的分離與鑒定試驗以及致病性測定。室內(nèi)抑菌試驗所用的殺菌劑為異菌脲、代森錳鋅、嘧菌酯、藍楷、京彩、秀苗、施灰樂均在市場上購買所得（表1）。

表1 7種殺菌劑和初篩濃度

1.2 病原菌的分離與形態(tài)學(xué)特征觀察

通過常規(guī)組織分離法進行病原菌的分離和培養(yǎng)。從草果葉片和果實病健交界處切下3 mm×3 mm×1 mm的小塊，用70%酒精消毒30 s，然后轉(zhuǎn)移到1%次氯酸鈉溶液中并浸泡2 min。然后無菌水洗滌3次，置于PDA+S培養(yǎng)基上，并在25℃的恒溫箱中培養(yǎng)7天[13]。等培養(yǎng)基上長有菌落后，將不同類型的菌落挑出并轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，直到純化出單個病原菌形態(tài)。產(chǎn)孢后，用顯微鏡觀察分生孢子，測量其大小。

1.3 分子生物學(xué)鑒定

在無菌操作臺上，用刀片輕輕刮下培養(yǎng)皿中病原菌菌絲，并將其收集至EP管中，采用TakaRa試劑盒進行DNA提取。

PCR反應(yīng)體系(50 μL)：5 U/μLTaq酶0.25 μL，10×PCR buffer(Mg2+plus)5 μL；2.5 mmol/L dNTP Mixture 4 μL；10 ng 模板DNA 1 μL；10 μmol/L ITS1/ITS4 引物各1 μL；滅菌雙重蒸餾水補足至50 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進行檢測，電壓85V，電泳時間30 min，Bio-Rad凝膠成像儀進行觀測、拍照。

先用真菌通用引物ITS1和ITS4擴增rDNA-ITS(ITS)序列[14]。將PCR產(chǎn)物送至華大公司測序，測得的序列在Gene Bank中進行Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)序列比對，分析序列同源性。為了進一步的確定分離菌株H1，通過用簡并引物EF1和EF2對EF1-α基因的一部分（登錄號MN308186）進行擴增。為了進一步的確定分離菌株T1，對肌動蛋白(ACT)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因區(qū)進行擴增，分析確定分離得到的菌株[15]。本實驗根據(jù)BLAST搜索結(jié)果，從NCBI官網(wǎng)下載相關(guān)序列，然后用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（表2）。

表2 引物序列

1.4 致病性測定

致病性測定試驗在溫室中進行。首先在溫室里種植20株草果，生長15天后，此時苗高30 cm，平均分為兩組，10株為對照組，10株為試驗組。將分離出的病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h，并用無菌水收集孢子。將孢子懸浮液調(diào)節(jié)至1×108個孢子/mL，并噴在試驗組草果的葉和莖上。然后將兩組草果分別放置在20±1℃和70%相對濕度的溫室中，每天觀察發(fā)病情況并記錄。待接種發(fā)病后，觀察致病力，并從病部再分離病原菌，比較所分離病原菌與原接種病原菌是否一致。

1.5 室內(nèi)抑菌效果的測定

采用菌絲生長速率法評價殺菌劑對植物病原菌的抑制效果[16]。首先用無菌水溶解藥劑，分別配制成100、100、10 mg/mL的母液，然后添加到PDA培養(yǎng)基（約50℃）中，分別配置成異菌脲(0.25、0.5、1 mg/mL)、代森錳鋅(0.625、1.25、2.5 mg/mL)、嘧菌酯(0.45、0.9、1.8 mg/mL)、藍楷（100倍液、400倍液、1500倍液）、京彩（100倍液、400倍液、1500倍液）、秀苗（100倍液、400倍液、1500倍液）、施灰樂（100倍液、400倍液、1500倍液）的含藥培養(yǎng)基，搖勻后倒平板，殺菌劑濃度設(shè)置見表3。以添加無菌水的培養(yǎng)基作為對照。每個濃度設(shè)置3次重復(fù)。待平板凝固后，用打孔器從長好的菌落邊緣打取4 mm直徑菌餅接入平板后，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，待對照菌絲將近長滿平皿時，以十字交叉的方式測定菌落的直徑。按公式(1)計算相對抑菌率。

表3 7種供試殺菌劑濃度設(shè)置

其中Y為菌絲生長抑制率(%)，d0為真菌盤直徑，d1為處理菌落直徑，d2為對照菌落直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 草果病害癥狀及病原菌形態(tài)觀察

從田間采集的樣品來看，開始時草果病株葉片有橢圓形黃褐色病斑，病斑逐漸增加，連成一片，整個葉片萎焉枯黃。草果莖基部和果實出現(xiàn)紅色，剝開表皮，維管束變成紅褐色，有紅色顆粒附著，嚴重時，莖基部干枯變紅（圖1）。

圖1 草果枯萎病和炭疽病發(fā)病癥狀

根據(jù)菌株在PDA平板上的形態(tài)、顏色、大小等特征，本實驗室從草果病組織上分離出了2種真菌病原菌。從草果莖基部分離出H1，在PDA平板上培養(yǎng)5天后，分離菌株H1的菌落是圓形和絨毛狀的，氣生的菌絲變得密集，菌落變成胭脂紅，帶有白色的邊緣，并在其中產(chǎn)生了紅色素（圖2A）。將該分離的真菌轉(zhuǎn)移到康乃馨葉瓊脂(CLA)中以誘導(dǎo)孢子形成。顯微鏡下觀察到大分生孢子，孢子大小為(43～90)μm×(2.7～5.4)μm。分生孢子的大分生孢子不等長，有4～6個裂片，有足形的基底細胞和細長的頂端細胞，形狀像鐮刀（圖2B）。菌落和分生孢子的形態(tài)與F.graminearum的描述相符[17]。

在草果葉片上分離的T1的菌落呈地毯狀并密集，菌落的外圓為白色，中間部分為灰色，黑色至深綠色。生長到后期的菌落在培養(yǎng)基表面顯示可見的粉紅色，偶爾可見的黑點散在分生孢子群（圖2C）。菌落和分生孢子的形態(tài)，與Weir[18]描述相同。孢子是無色且呈圓柱形的，測量了大約15個孢子，它們的寬度為3.58～5.72 μm，長度為10.45～17.35 μm（圖2D）。

圖2 禾谷鐮刀菌(A)和膠孢炭疽菌(C)的菌落和分生孢子形態(tài)特征

2.2 病原菌分子鑒定

病原ITS-PCR鑒定結(jié)果如圖3所示，條帶大小為500k～700 kb，清晰單一，PCR產(chǎn)物直接送華大基因公司進行測序。

圖3 病原菌ITS-PCR鑒定結(jié)果

2.3 序列信息及比對結(jié)果

測序結(jié)果顯示，H1和T1的ITS序列全長分別為501 bp和547 bp，將此序列與GenBank中的序列進行同源性比較，結(jié)果顯示，與禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)和膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)，序列同源性高達100%。為了進一步鑒定分離菌株H1，使用特異性引物EF1/EF2擴增EF-1α區(qū)域，將此序列與GenBank中的序列進行同源性比較，結(jié)果顯示，與禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)，序列同源性高達100%。為了進一步鑒定分離菌株T1，分別使用特異性引物738R/512F和GDF/GDR擴增了T1的ACT和GAPDH基因區(qū)域。將此序列與GenBank中的序列進行同源性比較，結(jié)果顯示，與膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)序列同源性分別高達99.18%和95.06%。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于ITS基因序列構(gòu)建分離菌株H1和T1的系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)菌株H1與已登錄的Fusarium graminearum(MN017275.1)和Fusariumasiaticum(MK791240.1)聚于相同進化支，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征鑒定結(jié)果和EF-1α基因鑒定結(jié)果確定菌株H1為禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)；發(fā)現(xiàn)菌株T1與已登錄的Colletotrichumgloeosporioides(MN473209.1)聚于相同進化支，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征鑒定結(jié)果和ACT和GAPDH基因鑒定結(jié)果確定菌株T1為膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)（圖4）。

圖4 基于ITS基因序列構(gòu)建分離菌株H1和T1的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 致病性分析

將分離的菌株中，即禾谷鐮刀菌和膠孢炭疽菌，接種于草果的幼葉。在室內(nèi)接種3天后，草果葉片表面出現(xiàn)黃褐色斑點，斑點外圈為黃色，中間為褐色至黑色，并伴有黑點（圖5）。對莖組織進行切片觀察，發(fā)現(xiàn)莖內(nèi)病變部位呈血紅色，有紅色顆粒狀物質(zhì)附著。接種組發(fā)病率為80%，對照組草果葉片健康，未出現(xiàn)病害癥狀。選擇具有典型發(fā)病癥狀的草果莖葉，重新進行病原菌分離與鑒定。結(jié)果表明，再次分離得到的菌株菌落形態(tài)與分離得到的菌株相同，符合柯赫氏法則，證明該菌株是引起草果病害的致病菌。

圖5 草果接種分離菌株H1和T1后莖葉的癥狀

2.6 7種殺菌劑室內(nèi)抑菌效果

采用含毒介質(zhì)培養(yǎng)法進行7種殺菌劑室內(nèi)抑菌實驗，圖6為加殺菌劑培養(yǎng)后菌絲的生長情況，可以看出用藥以后，不同的殺菌劑不同濃度對于病原菌的抑制效果也不同。所選的7種殺菌劑對草果上分離所得的3種病原菌的防治效果見表3。由表3可知，對于禾谷鐮刀菌，所選的7種殺菌劑中京彩的防治效果達到93%以上。對于炭疽病菌，代森錳鋅在田間推薦量區(qū)間內(nèi)可以百分百防治。藍楷、京彩、施灰樂低濃度時對其防治效果均達到了90%以上，防治效果極好，他們對擬莖點霉菌屬病原菌也有極好的防治效果?？傊?，京彩、施灰樂、代森錳鋅、藍楷4種藥劑對這2種病原菌均有較好的防治效果。

圖6 異菌脲、代森錳鋅、嘧菌酯、藍楷、京彩、秀苗、施灰樂7種殺菌劑作用于病原菌后菌絲生長情況

3 討論與結(jié)論

近年來，草果病害發(fā)生嚴重，其主要病害包括枯萎病，葉斑病和炭疽病。這些病害的發(fā)生呈上升趨勢，而且兩種病害復(fù)合發(fā)生現(xiàn)象嚴重，成為限制草果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要原因之一。國內(nèi)有一些關(guān)于草果病害鑒定的報道，大多只采用了病原菌形態(tài)特征鑒定，并且也很少見到在云南省怒江州種植的草果發(fā)生病害的報道[20-21]。本研究采用形態(tài)學(xué)鑒定并結(jié)合ITS，TEF，ACT和GAPDH序列分析確定病原菌的分類地位，分離鑒定出草果枯萎病和炭疽病的致病菌為禾谷鐮刀菌和膠孢炭疽菌。據(jù)我們所知，這是由禾谷鐮刀菌和膠孢炭疽菌引起的草果病害的國內(nèi)外首次報道。

表4 7種殺菌劑室內(nèi)抑制效果

禾谷鐮刀菌可侵染小麥、玉米等多種作物，引起小麥赤霉病和玉米穗腐病，而且還能產(chǎn)生真菌毒素，例如脫氧雪腐烯醇(DON)，降低作物的產(chǎn)量與品質(zhì)[22-23]。禾谷鐮刀菌侵染后，果實，莖部，根部都會表現(xiàn)癥狀，侵入維管束后，維管束變成褐色，葉部病斑多不規(guī)則，在潮濕環(huán)境下，病部會出現(xiàn)紅色霉層[24-25]。本試驗結(jié)果與其他作物分離出來的禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)致病菌一致，在國內(nèi)屬于首次發(fā)現(xiàn)。此外，ITS序列分析驗證了病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，但僅ITS序列分析不能確定禾本科植物的分類地位。因此，為了進一步鑒定分離物H1，用特異性引物EF1/EF2擴增H1的EF1-α基因。

膠孢炭疽菌能夠侵染草莓、柑橘、芒果等作物，可引起炭疽病的發(fā)生[26-28]。典型癥狀是葉片邊緣和表面出現(xiàn)斑點。病害發(fā)生初期，葉片上出現(xiàn)小的褐色斑點，擴張后呈近圓形和橢圓形。病害發(fā)生后期，病斑的中心變?yōu)榛野咨翜\棕色，并且在病斑上出現(xiàn)小黑點。為了進一步鑒定分離物T1，用特異性引物對肌動蛋白(ACT)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因區(qū)進行擴增。這些致病菌對草果病害癥狀的影響將需要在未來的研究中進行解釋。

云南當?shù)匚催M行草果主要病原菌對不同種類殺菌劑的防治篩選試驗，在藥劑防治中存在較大盲目性和隨意性，以致草果病害造成損失不斷增加。筆者針對生產(chǎn)需要，選取7種常見藥劑進行草果病原菌的室內(nèi)篩選試驗。室內(nèi)抑菌試驗表明，在選擇的7種殺菌劑中，京彩對禾谷鐮刀菌的防治效果高達93%，可以有效地控制禾谷鐮刀菌。對于膠孢炭疽菌，在劑量推薦的范圍內(nèi)，代森錳鋅能實現(xiàn)100%防治。據(jù)陳俊華等[29]報道膠孢炭疽菌對代森錳鋅高度敏感。在低濃度下，藍楷、京彩和施灰樂對膠孢炭疽菌均取得了90%以上的防治效果，防治效果極佳。其中藍楷是啶酰菌胺和吡唑醚菌酯的復(fù)合殺菌劑，具有殺菌廣譜性，還可以與其他不同作用機理的殺菌劑混用。京彩是一種與苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯復(fù)合的內(nèi)吸性殺菌劑。其作用機理是線粒體呼吸抑制劑，具有廣譜、低毒、環(huán)保，還可促進植物生長，抗早衰，有增產(chǎn)功效。施灰樂是一種是苯胺基嘧啶類殺菌劑，對灰霉病具有較好的防治效果，具有保護、治療、內(nèi)吸和熏蒸作用，通過抑制病原菌侵染酶的分泌，阻止病原菌的侵染。施灰樂可在植物體內(nèi)迅速傳導(dǎo)，殺菌較迅速徹底。代森錳鋅是一種保護性殺菌劑，在噴霧后可在農(nóng)作物表面形成致密的保護膜，以抑制病原菌的萌發(fā)和侵染。

結(jié)果表明，京彩，施灰樂，代森錳鋅和藍楷這4種殺菌劑對這2種致病菌具有良好的防治效果，而且這4種殺菌劑毒性低，可作為防治草果主要病害的首選或輪換藥劑。本試驗為防治草果病害提供了一定參考，但鑒于目前，草果病害的防控主要是單一化學(xué)防治殺菌劑，而病原菌具有廣泛的宿主范圍，快速的繁殖和較大的遺傳變異等特點，很容易產(chǎn)生抗藥性。特別是不科學(xué)地使用內(nèi)吸殺菌劑或增加施藥量已經(jīng)在一定程度上降低了病原菌對殺菌劑的敏感性，形成了耐藥性基團，導(dǎo)致化學(xué)防治效果不好，并且缺少大范圍的田間試驗。因此，防治草果病害中，為了延長藥劑的使用壽命，減少或延遲病原菌抗藥性，今后還應(yīng)該輪換使用不同種類的藥劑，也可以使用生物農(nóng)藥[30]，并開展大范圍的田間試驗，進一步明確使用范圍和條件，為云南草果病害防治提供依據(jù)。

本試驗通過形態(tài)學(xué)鑒定并結(jié)合ITS，TEF，ACT和GAPDH序列分析確定引起草果主要病害的病原菌是禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)和膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)，并通過菌絲生長速率法，明確7種殺菌劑對草果主要病害的防治效果，旨在為云南草果病害防治提供依據(jù)。結(jié)果表明，對于禾谷鐮刀菌，所選的7種殺菌劑中京彩的防治效果達到93%以上；對于膠孢炭疽菌，代森錳鋅在田間推薦量區(qū)間內(nèi)可以實現(xiàn)百分百防治，并且藍楷、京彩、施灰樂低濃度時對膠孢炭疽菌的防治效果均達到了90%以上。推薦京彩、施灰樂，代森錳鋅和藍楷作為云南省草果主要真菌病害的優(yōu)選兼治藥劑。