劉佳慧，姜希卿，張琪，王博琳，張吉龍，金君學(xué)*，孫婧陶*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.黑龍江省動物細(xì)胞與遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150030）

多精受精是指受精過程中，有2個或2個以上精子進(jìn)入卵母細(xì)胞的現(xiàn)象。與體內(nèi)受精相比，體外受精時多精受精的發(fā)生率增高，導(dǎo)致早期胚胎死亡、發(fā)育異常/阻滯等現(xiàn)象發(fā)生。豬物種在體外環(huán)境下多精受精發(fā)生率高達(dá)50%～90%，是研究多精受精的理想模型。卵母細(xì)胞成熟包括核成熟和質(zhì)成熟。第二次減數(shù)分裂中期第一極體排出是核成熟的標(biāo)志。胞質(zhì)成熟是指各種細(xì)胞內(nèi)事件，如能量調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)累積、細(xì)胞器（皮質(zhì)顆粒、高爾基體）重排等。然而，在卵母細(xì)胞體外成熟過程中，細(xì)胞核率先成熟，卵母細(xì)胞質(zhì)成熟的延遲使皮質(zhì)顆粒的遷移及胞吐受到抑制，導(dǎo)致多精受精發(fā)生。因此，通過改善卵母細(xì)胞的質(zhì)成熟將有效地抑制多精受精。

褪黑素作為一種強(qiáng)抗氧化劑，在卵母細(xì)胞體外成熟過程中可降低活性氧水平，保護(hù)卵母細(xì)胞免受氧化損傷的侵害；同時，還可以促進(jìn)卵母細(xì)胞脂質(zhì)代謝、改善線粒體功能，從而有效改善卵母細(xì)胞體外成熟的效率。然而，迄今為止，關(guān)于褪黑素在豬卵母細(xì)胞多精受精中的作用鮮有報道。本研究擬通過在豬卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中添加褪黑素，檢測卵母細(xì)胞體外成熟率、多精受精發(fā)生率及與多精受精相關(guān)的細(xì)胞器分布情況，以期探討褪黑素對豬卵母細(xì)胞多精受精的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究所有實(shí)驗(yàn)試劑均購置于Sigma（美國）公司，特殊說明的除外。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豬卵母細(xì)胞的收集與體外培養(yǎng) 從華欣眾貿(mào)肉業(yè)有限公司屠宰場獲得豬卵巢，置于25～30℃含青霉素和鏈霉素的生理鹽水中，2 h 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用18 號針頭抽取直徑為3～6 mm 卵泡內(nèi)的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（Cumulus-oocyte Complexs，COCs）。經(jīng)洗卵液洗滌3次，在體式顯微鏡下挑取卵母細(xì)胞胞質(zhì)均勻且周圍包裹多層致密卵丘細(xì)胞的COCs，移入覆蓋礦物油的500 μL卵母細(xì)胞體外成熟（In vitro Maturation，IVM）培養(yǎng)液中培養(yǎng)21 h，再轉(zhuǎn)移至無激素（PMSG 和hCG）的IVM 培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)21 h，培養(yǎng)條件為38.5℃、5%CO飽和濕度環(huán)境。

IVM 培養(yǎng)液采用TCM-199（Invitrogen）作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，添加0.6 mmol/L 半胱氨酸，0.91 mmol/L丙酮酸鈉，10 ng/mL EGF，10% 豬卵泡液，10 IU/mL PMSG，10 IU/mL hCG，1%青鏈霉素（Invitrogen）。在IVM 培養(yǎng)液中，褪黑素組、褪黑素+Luzindole 組分別添加1 nmol/L 褪黑素、1 nmol/L 褪黑素+1 nmol/L Luzindole（選擇性褪黑素受體拮抗劑），不添加褪黑素及Luzindole 組作為對照組，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 卵母細(xì)胞體外受精及胚胎培養(yǎng) COCs 經(jīng)42 h 體外成熟后，使用0.05%透明質(zhì)酸酶去除卵母細(xì)胞周圍包裹的卵丘細(xì)胞，將成熟卵母細(xì)胞每15 枚置于25 μL 受精滴中。取1 mL 精液（精液由哈爾濱市雙城區(qū)富泉種豬廠提供）置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育15 min，2 000 r/min離心4 min；棄上清，加入1 mL DPBS，2000 r/min 離心4 min；棄上清，加入1 mL mTBM，重懸；按照500:1的精卵比稀釋精液。在受精進(jìn)行之前，要確保精子活力>80%。取25 μL 精液加入受精滴中，置于38.5℃、5%CO飽和濕度環(huán)境下孵育6 h 后，轉(zhuǎn)移至PZM3 胚胎培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 觀察卵裂率，168 h 觀察囊胚率。

1.2.3 體外多精受精發(fā)生率的檢測 受精卵于PZM3 胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)10 h 后，移入0.2% PVA-PBS 中洗滌3 次，每次1～2 min；將受精卵移入0.1%濃鹽酸中，停留2～3 s，去除透明帶；置于0.2% PVA-PBS 中洗滌3 次，每次1～2 min；使用10 μg/mL Hoechst 33342 將無透明帶的受精卵室溫下染色5 min，0.2% PVA-PBS 中洗滌3 次，每次1～2 min；凡士林封片，于熒光顯微鏡（Nikon，80i）下觀察豬卵母細(xì)胞原核形成情況，統(tǒng)計多精受精發(fā)生率：雙原核為正常受精；3個以上原核為多精受精。

1.2.4 皮質(zhì)顆粒染色 將成熟卵母細(xì)胞置于4% 多聚甲醛中固定30 min；用含0.3% BSA+1 mol/L 甘氨酸的PBS（封閉液）清洗3 次，每次5 min；卵母細(xì)胞移入含0.1% Triton-X100 的PBS 中通透5 min，使用封閉液清洗3 次，每次5 min；卵母細(xì)胞放置到100 μg/mL 的FITC-PNA（Sigma，L7381）中室溫避光染色30 min；凡士林封片，使用激光共聚焦顯微鏡（Leica，TCS SP8）觀察皮質(zhì)顆粒分布情況。皮質(zhì)顆粒正常分布率計算方法：各組正常分布的卵母細(xì)胞個數(shù)/各組卵母細(xì)胞總數(shù)。

1.2.5 高爾基體染色 將成熟卵母細(xì)胞置于4%多聚甲醛中固定10 min，使用預(yù)冷的0.2% PVA-PBS 清洗3 次，每次1～2 min；卵母細(xì)胞移入5 mmol/L NBD C6-Ceramide（GeneCopoeia,C049）中，4℃ 避光染色30 min，使用預(yù)冷的0.2% PVA-PBS 清洗3 次，每次1～2 min；移入2%BSA-PBS 中室溫孵育60 min，使用預(yù)冷的0.2% PVAPBS 清洗3 次，每次1～2 min；凡士林封片，使用熒光顯微鏡觀察高爾基體分布情況。高爾基體正常分布率計算方法：各組正常分布的卵母細(xì)胞個數(shù)/各組卵母細(xì)胞總數(shù)。

1.3 統(tǒng)計分析 每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0 通過單因素方差分析（ANOVA）和Duncan's檢驗(yàn)進(jìn)行分析，結(jié)果使用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 褪黑素對豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響 由表1 可知，3 組之間卵母細(xì)胞成熟率無顯著性差異，即褪黑素處理未對豬卵母細(xì)胞核成熟率產(chǎn)生顯著影響。

表1 褪黑素對豬卵母細(xì)胞體外成熟率的影響

2.2 褪黑素對豬體外受精胚胎發(fā)育能力的影響 表2 顯示，各處理組卵裂率無顯著差異，但在培養(yǎng)168 h 后，褪黑素組的囊胚率顯著高于對照組和褪黑素+Luzindole組，后2 組間差異不顯著。

表2 褪黑素對豬體外受精胚胎發(fā)育能力的影響

2.3 褪黑素對豬卵母細(xì)胞多精受精發(fā)生率的影響 在胚胎培養(yǎng)10 h 后，檢測豬卵母細(xì)胞多精受精發(fā)生情況，如表3 所示，褪黑素組的多精受精率低于對照組及褪黑素+Luzindole 組（<0.05），雙原核胚胎形成率高于其他2 組（<0.05）。

表3 褪黑素對豬卵母細(xì)胞多精受精發(fā)生率的影響

2.4 褪黑素對成熟豬卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒分布情況的影響由圖1 可知，褪黑素組皮質(zhì)顆粒正常分布率高于對照組和褪黑素+Luzindole 組（<0.05）。

圖1 褪黑素對成熟豬卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒分布情況的影響

2.5 褪黑素對成熟豬卵母細(xì)胞高爾基體分布情況的影響由圖2 可知，褪黑素組高爾基體正常分布率高于對照組和褪黑素+Luzindole 組 （<0.05）。

圖2 褪黑素對成熟豬卵母細(xì)胞高爾基體分布情況的影響

3 討 論

本研究于豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加褪黑素或褪黑素+Luzindole，檢測褪黑素對豬卵母細(xì)胞體外成熟及多精受精中的影響，結(jié)果顯示，各組間卵母細(xì)胞核成熟率無顯著差異，而褪黑素組多精受精率顯著下降，體外受精后囊胚形成率顯著提高，同時，卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒、高爾基體正常分布率顯著增加。

3.1 褪黑素對豬卵母細(xì)胞體外成熟及胚胎發(fā)育的影響褪黑素作為重要的抗氧化劑，在卵母細(xì)胞體外成熟過程中發(fā)揮著極為重要的作用。有研究表明，在小鼠、牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中添加褪黑素可以明顯改善卵母細(xì)胞的胞質(zhì)成熟能力，如改善線粒體功能，提高GSH、ATP 水平及抗氧化基因的表達(dá)，改善DNA 損傷，調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞脂質(zhì)代謝，改善卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量等。本研究中，卵母細(xì)胞核成熟數(shù)據(jù)顯示，各組間核成熟率并無顯著性差異。在此前的研究中，He和Yaacobi-Artzi 等分別在小鼠和牛中也發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果。而后，將成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精，發(fā)現(xiàn)褪黑素可顯著提高囊胚形成率，而在褪黑素及其拮抗劑Luzindole 共培養(yǎng)時，該現(xiàn)象被明顯抑制。據(jù)此推測，在豬卵母細(xì)胞體外成熟過程中，添加外源褪黑素盡管未能提高核成熟率，但很有可能提高卵母細(xì)胞的胞質(zhì)成熟能力，進(jìn)而改善體外受精胚胎的發(fā)育能力。

3.2 褪黑素對豬卵母細(xì)胞多精受精的影響 據(jù)報道，卵母細(xì)胞的體外受精及胚胎發(fā)育能力與卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量密切相關(guān)，但在體外成熟過程中，卵母細(xì)胞常常受到氧化應(yīng)激影響，導(dǎo)致核質(zhì)成熟不同步，即當(dāng)卵母細(xì)胞內(nèi)的胞質(zhì)成熟相關(guān)因子如細(xì)胞器分布等積累到成熟標(biāo)準(zhǔn)之前，細(xì)胞核會率先成熟，致使卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量較差。當(dāng)質(zhì)量較差的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精時，阻止多精受精的屏障尚未建立完全，即皮質(zhì)反應(yīng)或透明帶反應(yīng)不充分。本研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可顯著提高豬卵母細(xì)胞體外受精后的雙原核胚胎率，同時顯著降低多精受精的發(fā)生率。本研究結(jié)果證實(shí)褪黑素可顯著降低豬卵母細(xì)胞多精受精的發(fā)生。

3.3 褪黑素對豬卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒及高爾基體分布的影響 皮質(zhì)顆粒是受精前存在于卵母細(xì)胞質(zhì)膜下的皮質(zhì)層中的分泌小泡。在卵母細(xì)胞成熟過程中，皮質(zhì)顆粒數(shù)量不斷增加并逐漸向質(zhì)膜遷移，呈線狀排列，這是卵母細(xì)胞質(zhì)成熟的標(biāo)志之一。卵母細(xì)胞受精時，當(dāng)?shù)?個精子與卵母細(xì)胞融合，皮質(zhì)顆粒會發(fā)生胞吐作用，以防止其余精子與卵母細(xì)胞融合。卵母細(xì)胞體外受精過程中的多精受精率較高，一部分原因是由于皮質(zhì)顆粒未遷移至質(zhì)膜區(qū)域或皮質(zhì)顆粒數(shù)量較少，致使皮質(zhì)反應(yīng)不充分，從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞不能有效阻止多精入卵。本研究通過檢測皮質(zhì)顆粒在成熟卵母細(xì)胞中的分布情況，發(fā)現(xiàn)在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加褪黑素可以顯著提高皮質(zhì)顆粒正常分布率。皮質(zhì)顆粒在卵母細(xì)胞的高爾基體中產(chǎn)生，同時，高爾基體作為蛋白質(zhì)合成及運(yùn)輸?shù)募?xì)胞器，在卵母細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮著重要作用。Cui 等研究表明，在卵母細(xì)胞成熟過程中添加高爾基體特異性抑制劑會導(dǎo)致減數(shù)分裂進(jìn)程的損害，同時卵母細(xì)胞的胞質(zhì)成熟指標(biāo)如線粒體分布及皮質(zhì)顆粒分布出現(xiàn)異常。本研究通過檢測卵母細(xì)胞中高爾基體分布情況，發(fā)現(xiàn)在豬卵母細(xì)胞成熟過程中添加褪黑素可以顯著提高高爾基體的正常分布率。由此表明，褪黑素可以明顯提高與多精受精相關(guān)的細(xì)胞器，即皮質(zhì)顆粒和高爾基體在成熟豬卵母細(xì)胞中的正常分布情況。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在豬卵母細(xì)胞體外成熟過程中添加1nmol/L 的褪黑素雖然沒有提高豬卵母細(xì)胞的核成熟率，但可明顯提高豬卵母細(xì)胞體外受精后囊胚形成率，同時提高了豬卵母細(xì)胞成熟時期的皮質(zhì)顆粒、高爾基體的正常分布率，進(jìn)而抑制了豬卵母細(xì)胞的多精受精發(fā)生