侯文欣，潘洋洋，車雨彤，秦朋云，趙祥，喬利英，劉建華，劉文忠

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801）

在自然界中，生物體經(jīng)常面臨能量獲取不足的情況，所以需要在能量充足時將多余能量儲存起來。脂肪組織能夠動態(tài)的儲存能量，在機體能量消耗過多或攝入不足時供能，但過多的脂肪分解會減少體內(nèi)脂肪沉積。脂肪沉積分為內(nèi)臟脂肪沉積和肌內(nèi)脂肪沉積，多余的內(nèi)臟脂肪沉積會影響家畜產(chǎn)肉率，而肌內(nèi)脂肪的沉積會提高肉質(zhì)口感。羊肉營養(yǎng)價值較高，食之能暖身補身，深入探究羊肉脂肪沉積相關(guān)基因的重要性不言而喻。

腫瘤蛋白p53 誘導(dǎo)的核蛋白2（Tumor Protein 53-Induced Nuclear Protein 2，TP53INP2）又稱糖尿病和肥胖調(diào)控蛋白（DOR），在人的淋巴細胞中首次發(fā)現(xiàn)。TP53INP2 蛋白能夠作為甲狀腺激素受體（TR）的轉(zhuǎn)錄輔激活因子參與甲狀腺激素介導(dǎo)的成肌分化和成骨分化過程。TP53INP2 蛋白在細胞代謝中發(fā)揮雙重作用。一方面，TP53INP2 蛋白通過促進rDNA 啟動子處RNA 聚合酶I 前起始復(fù)合物的組裝促進rDNA 轉(zhuǎn)錄，參與核糖體生物合成；另一方面，在營養(yǎng)缺乏的條件下，該蛋白在細胞核中與自噬相關(guān)蛋白LC3 結(jié)合，移至細胞質(zhì)中參與細胞自噬。許多研究表明，自噬在脂肪形成和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。近期研究表明，基因與脂肪細胞分化相關(guān)，但在小鼠和牛中所起的作用相反。過表達小鼠3T3-L1 前體脂肪細胞中的基因，發(fā)現(xiàn)形成的脂滴減少，脂肪細胞分化標志基因的表達量降低，表明基因抑制小鼠前體脂肪細胞的分化。但是過表達秦川牛前體脂肪細胞中的基因，導(dǎo)致形成的脂滴增加，脂肪細胞分化標志基因的表達量升高，表明基因促進牛前體脂肪細胞的分化。造成這種結(jié)果的原因可能是物種差異，也可能是基因參與的脂肪細胞分化通路不同。牛和羊均屬于反芻動物，通過研究綿羊基因在前體脂肪細胞分化中的作用，與在小鼠和牛中的作用進行比較，可以初步判斷是否因為物種差異導(dǎo)致上述結(jié)果。

目前有關(guān)綿羊基因的報道較少。本課題組前期高通量測序結(jié)果表明，基因在廣靈大尾羊和湖羊尾部脂肪中表達量差異顯著。廣靈大尾羊為長脂尾型羊，湖羊為短脂尾型羊。前期高通量測序的差異結(jié)果提示該基因可能對脂肪沉積起作用。因此，本實驗選用廣靈大尾羊進行研究，克隆基因CDS 區(qū)，分析基因mRNA 序列及其編碼蛋白的性質(zhì)，并檢測5 種脂肪組織中該基因的表達情況，為研究基因在綿羊脂肪代謝中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 在屠宰場隨機挑選4 只8 月齡的廣靈大尾羊，屠宰后在無菌條件下迅速采集皮下脂肪、尾部脂肪、腹膜后脂肪、腎周脂肪和腸系膜脂肪組織。將各組織分裝于標記好的凍存管后，迅速放入液氮中，后轉(zhuǎn)至-80℃保存。

1.2 主要試劑 RNAiso Plus、PrimeSTARHS（Premix）、DL 2000 DNA Marker、DNA Loading Buffer、PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）和TB GreenPremix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）均購自日本TaKaRa 公司；Poly-Gel DNA Extraction Kit 購自美國Omega 公司；50×TAE 溶液、大腸桿菌DH5感受態(tài)細胞、瓊脂糖和氨芐青霉素均購自北京索萊寶公司；pHBLV-CMVIE-ZsGreen-T2A-Puro 載體購自漢恒生物科技（上海）有限公司；ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit 購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 基因引物 根據(jù)NCBI 上綿羊的基因序列（XM_027977111.1），使用Primer Primier 5.0 軟件和GenScript Primer Design 在線工具設(shè)計特異性引物，選用作為內(nèi)參基因（所有引物見表1），引物均由Thermo Fisher 公司合成。

表1 引物信息

1.4 RNA 與cDNA 獲取 參考Trizol 試劑盒說明書提取5 種脂肪組織的總RNA 后，吸取1 μL 打入核酸蛋白測定儀孔內(nèi)，檢測RNA 的濃度和純度值（OD/OD）。檢測合格后參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，測濃度和純度后放入-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5基因CDS 區(qū)克隆與測序 PCR 反應(yīng)體系為15.8 μL：2×PrimeSTAR HS（Premix）7.6 μL，引物各0.6 μL，模板cDNA 1 μL，ddHO 6 μL。程序為：95 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 10 s，72 ℃ 60 s，設(shè)為30個循環(huán)；72℃ 5 min；4℃終止反應(yīng)。反應(yīng)完畢后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，對正確條帶快速切膠，并回收純化目的片段。參照無縫克隆試劑盒說明書連接目的片段與載體后，轉(zhuǎn)至感受態(tài)細胞中，涂抹在固體培養(yǎng)基上并在37℃培養(yǎng)箱中過夜。挑選5個單克隆菌落進行搖菌后，送至Thermo Fisher 公司測序。

1.6 生物信息學(xué)分析 使用DNAMAN Version 6（Lynnon Biosoft，USA）軟件分析綿羊基因的測序結(jié)果；使用DNASTAR.Lasergene.v7.1（DNASTAR Inc.，USA）軟件將該基因的mRNA 序列與山羊（XM_01805 7741.1）、黃牛（XM_003586843.5）、野豬（XM_003 359949.4）、小鼠（NM_178111.3）、大鼠（NM_00127 0947.1）、人類（NM_021202.3）和黑猩猩（XM_0011 60082.4）進行比對；使用Mega-X Version 10.1.8（Mega Limited，NZL）軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；使用ProtParam Tool（https://web.expasy.org/protparam/）分析TP53INP2蛋白的理化性質(zhì)；使用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）分析TP53INP2 蛋白的親疏水性；使用NetPhos 3.0 Sever（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測TP53INP2 蛋白的磷酸化位點；使用PSORT II（https://www.genscript.com/tools/psort）預(yù)測TP53INP2 蛋白的亞細胞定位；使用TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù) 測TP53INP2 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；使用SignalP 4.1 Server（http://www.detaibio.com/tools/signal-peptide.html）預(yù)測TP53INP2 蛋白的信號肽；使用NetNGlyc 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）預(yù)測TP53INP2 蛋白的N-糖基化位點；使用NetOGlyc 4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）預(yù)測TP53INP2 蛋白的O-糖基化位點；使用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測TP53INP2 蛋白的二級結(jié)構(gòu)；使用Phyre 2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/phyre2 output/）構(gòu)建TP53INP2 蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型。

1.7 實時熒光定量PCR 以1.4 中獲取的cDNA 為模板進行實驗。反應(yīng)體系為10 μL：TB Green Premix Ex Taq II 5 μL；上、下游引物各0.4 μL；cDNA 2 μL；ddHO 2.2 μL。程序為：95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃15 s，72℃ 20 s，設(shè)為40個循環(huán)；95℃ 5 s，65℃ 1 min?？截惙磻?yīng)結(jié)束后的結(jié)果用于數(shù)據(jù)分析。

1.8 統(tǒng)計分析 以腹膜后脂肪為對照，為內(nèi)參，采用2法計算拷貝數(shù)據(jù)；使用GraphPad Prism 7.0（GraphPad Software Inc.，USA）軟件作圖并分析，差異顯著判斷標準為<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1基因CDS區(qū)克隆與測序PCR反應(yīng)結(jié)束后的電泳結(jié)果顯示，675 bp 處有一條清晰明亮的條帶（圖1）。測序結(jié)果經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)與綿羊（XM_027977111.2）目的序列完全一致，表明成功克隆出廣靈大尾羊基因的CDS 區(qū)。

圖1 TP53INP2基因PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖

2.2mRNA 序列比對與進化樹構(gòu)建 綿羊mRNA 序列與山羊、黃牛、大鼠、人類、小鼠、野豬和黑猩猩的相似性分別為99%、96.4%、65.5%、72.4%、65.4%、80.8% 和72.3%（圖2）。Mega-X 軟件構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹中，綿羊與山羊親緣關(guān)系最近，與大鼠和小鼠親緣關(guān)系最遠（圖3），與序列相似性比對分析結(jié)果相一致。

圖2 不同物種間TP53INP2mRNA 序列相似性比對

圖3 不同物種間TP53INP2mRNA 序列進化樹遺傳距離關(guān)系

2.3 TP53INP2 蛋白理化性質(zhì)與親疏水性分析 將TP53INP2 蛋白序列輸入ProtParam 軟件中，結(jié)果顯示該基因可編碼224個氨基酸，TP53INP2 蛋白分子質(zhì)量為24 320.28 u，理論等電點（pI）為5.54，分子式為CHNOS，總原子數(shù)為3 382；不穩(wěn)定系數(shù)為77.63，是不穩(wěn)定蛋白；親水性總平均值為-0.596。利用ProtScale 軟件做進一步的親疏水性分析，結(jié)果如圖4 所示，縱坐標負值表示親水區(qū)，可見組成TP53INP2蛋白的氨基酸多集中在負值，整體表現(xiàn)為親水性，與ProtParam 軟件預(yù)測親水性的結(jié)果相同。

圖4 TP53INP2 蛋白親疏水性分析

2.4 磷酸化位點與糖基化位點預(yù)測 NetPhos 3.0 Sever軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，TP53INP2 蛋白潛在的磷酸化位點如圖5 所示，絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸位點分別存在14、2、1個。NetNGlyc 1.0 Server 和NetOGlyc 4.0 Server軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，TP53INP2 蛋白不存在N-糖基化位點，存在7個O-糖基化位點，分別位于第7、11、50、124、140、189、202 位氨基酸處。

圖5 TP53INP2 蛋白磷酸化位點

2.5 信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)與亞細胞定位預(yù)測 SignalP 4.1 Server 軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，TP53INP2 蛋白前70個氨基酸的C-score、S-score 和Y-score 均小于0.2，在閾值0.5之下，說明該蛋白不存在信號肽。TMHMM Server v.2.0軟件預(yù)測表明，TP53INP2 蛋白不存在跨膜區(qū)。PSORT II 軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，TP53INP2 蛋白主要分布在細胞核（47.8%），少量分布在細胞質(zhì)（8.7%）、液泡（4.3%）和線粒體（4.3%）中。

2.6 蛋白二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 TP53INP2 蛋白二級結(jié)構(gòu)的-螺旋、延伸鏈、-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲分別占23.66%、13.39%、1.79% 和61.16%（圖6）。所構(gòu)建的三級結(jié)構(gòu)如圖7 所示。

圖6 TP53INP2 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖7 TP53INP2 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.7 實時熒光定量PCR 結(jié)果分析基因在廣靈大尾羊5 種脂肪組織中均有表達，其中在皮下脂肪組織中表達量最高，其次是尾部脂肪組織，腹膜后脂肪組織中表達量最低；在皮下脂肪組織與其余4 種脂肪組織中均有顯著差異；在腹膜后脂肪、腎周脂肪和腸系膜脂肪組織中的差異不顯著（圖8）。

圖8 TP53INP2基因在廣靈大尾羊各脂肪組織的表達量

3 討 論

自噬是一種細胞必需的、保守的自我進食過程，可降解可溶性蛋白、聚集蛋白、細胞器、大分子復(fù)合物和異物，該過程需要形成自噬體的雙膜結(jié)構(gòu)，最終與溶酶體融合。有研究表明，TP53INP2 能夠調(diào)控哺乳動物和果蠅細胞中自噬體的形成來參與細胞自噬。在小鼠骨骼肌中，敲除基因，骨骼肌自噬水平下降，小鼠肌肉肥大，表明TP53INP2 通過激活自噬負調(diào)控小鼠骨骼肌的生成。此外，TP53INP2 還可以促進糖原合成酶激酶3（GSK3）的隔離，通過將其隔離到膜包裹的囊泡結(jié)構(gòu)中激活WNT 通路抑制脂肪前體細胞的分化，而TP53INP2 隔離GSK3的作用依賴于自噬活性。近年來研究表明，在細胞核內(nèi)TP53INP2能與LC3 結(jié)合，之后TP53INP2-LC3 復(fù)合物從細胞核移至細胞質(zhì)，與自噬相關(guān)蛋白ATG7 相互作用，從而促進自噬體的生物發(fā)生。本研究預(yù)測顯示，綿羊TP53INP2 蛋白大量定位于細胞核內(nèi)，少量定位于細胞質(zhì)，提示該蛋白通過自噬調(diào)控綿羊的肌肉和脂肪生成。

基因在進化上高度保守，研究表明，小鼠TP53INP2 氨基酸序列與哺乳動物的相似性均大于70%。在本研究中，綿羊基因的mRNA序列與哺乳動物的相似性均大于64.8%，說明該基因在進化上高度保守。蛋白理化性質(zhì)預(yù)測顯示，TP53INP2蛋白等電點為5.54。理論等電點可以在等電聚焦電泳以及使用離子交換層析分離純化蛋白時作為參考。不穩(wěn)定系數(shù)起判斷目的蛋白穩(wěn)定性的作用，當不穩(wěn)定系數(shù)大于40 為不穩(wěn)定蛋白。TP53INP2 蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為77.63，說明該蛋白是不穩(wěn)定蛋白。蛋白質(zhì)磷酸化主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上，能夠使蛋白質(zhì)在具有電荷后結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，以此來調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活性。本研究預(yù)測顯示，TP53INP2 蛋白存在17個潛在的磷酸化位點，說明該蛋白的功能可能由氨基酸的磷酸化產(chǎn)生。蛋白質(zhì)糖基化主要分為N-糖基化和O-糖基化，對蛋白質(zhì)折疊、可溶性、穩(wěn)定性和亞細胞定位起重要作用。O-糖基化主要將糖基加至絲氨酸或蘇氨酸上，與磷酸化存在競爭關(guān)系，這種競爭性修飾對轉(zhuǎn)錄很重要。TP53INP2 蛋白存在7個O-糖基化位點，說明該蛋白可能通過磷酸化位點與糖基化位點的競爭參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。信號肽是蛋白質(zhì)N-末端的短肽鏈，靶向真核生物的分泌途徑。TP53INP2 蛋白不存在跨膜區(qū)和信號肽，說明該蛋白不屬于膜蛋白和分泌蛋白。有研究表明，TP53INP2 蛋白在人和大鼠中主要定位于細胞核內(nèi)，與TR 相互作用，增強其轉(zhuǎn)錄活性。在本研究中，預(yù)測TP53INP2 蛋白主要定位于細胞核，提示該蛋白在綿羊中發(fā)揮同樣作用。無規(guī)則卷曲容易被側(cè)鏈相互作用影響，是造成蛋白不穩(wěn)定的重要原因。預(yù)測顯示，TP53INP2 蛋白二級結(jié)構(gòu)的無規(guī)則卷曲占比高達61.16%，說明該蛋白穩(wěn)定性差，這與理化性質(zhì)預(yù)測該蛋白是不穩(wěn)定蛋白的結(jié)果相符。

脂肪遍及全身各個地方，可將白色脂肪組織分為皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪。通常，皮下脂肪指所有皮膚下層的脂肪組織，尾脂也屬于皮下脂肪，具有保溫、儲能及參與代謝等功能；內(nèi)臟脂肪指沉積于內(nèi)臟周邊的脂肪組織，對內(nèi)臟起保護作用，儲能能力比皮下脂肪小。有研究表明，在秦川牛脂肪細胞中，過表達基因能引起基因表達量的升高，促進前體脂肪細胞的分化。在廣靈大尾羊中，尾部脂肪基因的表達量高于腎周、小網(wǎng)膜和腸系膜脂肪，表現(xiàn)為皮下脂肪表達量高于內(nèi)臟脂肪。基因在脂肪細胞增殖和分化過程中起主要調(diào)控作用，活化的基因能夠增加脂肪細胞數(shù)量，促進脂肪細胞分化。在本研究中，基因在廣靈大尾羊皮下脂肪的表達量最高，尾部脂肪的表達量高于腎周、腸系膜和腹膜后脂肪，整體表現(xiàn)為皮下脂肪表達量高于內(nèi)臟脂肪，與基因的表達趨勢相同。推測基因可能通過促進基因的表達促進綿羊前體脂肪細胞的分化。

4 結(jié) 論

TP53INP2 蛋白是一種不穩(wěn)定的親水性蛋白，存在17個潛在的磷酸化位點和7個O-糖基化位點，可能通過磷酸化位點與O-糖基化位點的競爭發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用?；蛟趶V靈大尾羊5 種脂肪組織中均有表達，總體呈皮下脂肪表達量高于內(nèi)臟脂肪，該結(jié)果提示基因可能有促進綿羊脂肪沉積的功能。本實驗結(jié)果可為研究基因在綿羊脂肪代謝中的作用提供一定參考。