蔡衛(wèi)忠，吳早林，全 濤，劉澤文，田永祥

（1.紅安縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖北 紅安 438499；2.鶴峰縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖北 鶴峰 445800；3.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細菌病防治制劑創(chuàng)制重點實驗室/畜禽病原微生物學(xué)湖北省重點實驗室，武漢 430064）

為了驗證C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗原的保護效果，確定仔豬大腸桿菌?。↘88+K99+987P）、產(chǎn)氣莢膜梭菌?。– 型）二聯(lián)滅活疫苗配制中的抗原含量，開展了試驗研究。

1 材料

1.1 菌種

制苗及檢驗用C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌C59-2 菌株，F(xiàn)10 代基礎(chǔ)種子，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所制備、檢驗和保存。

1.2 梭菌液體培養(yǎng)基配制

按照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》［1］中的方法進行制備。

1.3 凍干保護劑配制

準確稱取明膠20 g、蔗糖100 g，充分溶解于950 mL 純化水中，用2 mol/L NaOH 調(diào)pH 至7.2～7.6，加純化水定容至1 000 mL，116 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后備用。

1.4 疫苗稀釋液

氫氧化鋁膠生理鹽水稀釋液，由武漢中博生物股份有限公司制備、檢驗和保存。

1.5 試驗動物

16～20 g 昆明小鼠，購自武漢生物制品研究所；懷孕69～74 d 母豬（C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素中和抗體陰性）8 頭，購于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所試驗豬場。

2 方法

2.1 抗原的制備

按照文獻［2］進行C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌C59-2 菌株的培養(yǎng)，取樣測定毒素的含量，將毒素用甲醛滅活脫毒，經(jīng)超濾系統(tǒng)進行濃縮。

2.2 疫苗的配制

根據(jù)濃縮毒素的含量，用無菌生理鹽水分別稀釋至2 000、3 000、4 000 MLD/mL 3 個濃度，然后加入與抗原等體積的凍干保護劑，充分攪拌混勻，定量分裝每瓶2 mL，經(jīng)冷凍真空干燥制成疫苗，加蓋密封貼簽，制備3 種不同毒素抗原含量單苗，每頭份疫苗的毒素含量分別為2 000、3 000、4 000 MLD（以脫毒前計）。

2.3 試驗?zāi)肛i分組

將8 頭懷孕69～74 d 母豬（產(chǎn)前40～45 d）隨機分為4 組，分別為3 個免疫組（每組2 頭）和1 個對照組（2 頭）。分組后將豬依次編號，分欄飼養(yǎng)。

2.4 免疫

將3 種疫苗隨機取樣，用稀釋液稀釋成每頭份2 mL，平衡至室溫后使用，采用肌肉注射接種途徑，每種疫苗接種2 頭懷孕母豬，于產(chǎn)前40～45 d 一免，每頭豬注射疫苗2 mL，25 d后按同樣劑量進行二免。

2.5 哺乳仔豬攻毒試驗

母豬產(chǎn)仔后，在各免疫組母豬所產(chǎn)仔豬中隨機選取5 頭，用C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌C59-2 毒素攻毒。在未免疫組母豬所產(chǎn)仔豬中隨機選取10 頭分為2組，分別為攻毒對照組和正常對照組，每組5 頭（表1）。哺乳仔豬于出生并采食初乳24 h 內(nèi)攻毒，對免疫組及攻毒對照組，靜脈注射最小致死劑量的C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素。攻毒后連續(xù)觀察5 d，根據(jù)仔豬攻毒后的臨床表現(xiàn)統(tǒng)計各試驗組的發(fā)病情況。

表1 疫苗抗原含量與攻毒保護平行關(guān)系試驗分組情況

3 結(jié)果

3.1 母豬分娩情況

8 頭母豬均成功分娩，無流產(chǎn)現(xiàn)象。統(tǒng)計產(chǎn)仔情況，產(chǎn)仔總數(shù)為84 頭，仔豬均健活，無弱仔和死胎，免疫組和對照組產(chǎn)仔情況無明顯差異（表2）。

表2 母豬產(chǎn)仔情況

3.2 哺乳仔豬攻毒試驗結(jié)果

用最小致死劑量的C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素對免疫和對照組母豬所產(chǎn)并采食初乳24 h 內(nèi)仔豬攻毒。攻毒對照組在攻毒后24 h 內(nèi)全部死亡，毒素含量為2 000、3 000、4 000 MLD/mL 疫苗免疫組所產(chǎn)仔豬對梭菌毒素攻毒后的保護率分別為60%、80%、100%（表3）。

表3 梭菌疫苗免疫組仔豬攻毒試驗結(jié)果

4 結(jié)論與討論

C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌主要引起新生仔豬紅痢，主要發(fā)生于3 日齡以內(nèi)的新生仔豬［3］，發(fā)病仔豬以腹瀉為主要臨床癥狀，而且發(fā)病急劇，病程短促，發(fā)病率和死亡率均較高，注射疫苗是預(yù)防該病發(fā)生的有效手段［4］。C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素均具有很好的免疫原性，能夠刺激機體產(chǎn)生抗體，抵抗C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌的攻擊［5］。

試驗結(jié)果表明，用C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素制成的疫苗對懷孕母豬安全，免疫母豬均正常產(chǎn)仔，產(chǎn)仔數(shù)與對照組母豬無明顯區(qū)別，且無死胎和弱仔。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活疫苗不同毒素抗原含量與攻毒保護率具有良好的平行關(guān)系，毒素抗原含量不低于3 000 MLD/mL 時，免疫組攻毒保護率不低于80%。確定了使仔豬獲得保護的最低產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗原含量為3 000 MLD/mL。為了確保疫苗的質(zhì)量，將每頭份仔豬大腸桿菌?。↘88+K99+987P）、產(chǎn)氣莢膜梭菌病（C 型）二聯(lián)滅活疫苗產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗原最低值確定為4 000 MLD/mL。