曹 輝

（沈陽工學(xué)院生命工程學(xué)院，沈陽 撫順 113122）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）又稱“藍(lán)耳病”，是一種危害大、難以控制的豬高度接觸傳染性疾病，主要是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染造成。主要臨床表現(xiàn)為母豬繁殖障礙（晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎）、仔豬呼吸障礙、非特異性淋巴單核性和間質(zhì)性肺炎甚至死亡等［1-4］。由于PRRSV 的變異性很高，在疫苗和藥物的研究方面比較困難。

小RNA 又稱為microRNA（miRNA），是一類內(nèi)源性非編碼RNA 分子，長度約為22 個堿基，且保守性很高。它可以與靶mRNA 進(jìn)行互補(bǔ)或者部分互補(bǔ)，使mRNA 降解或?qū)е缕浞g受抑制，作為重要的轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)因子用于調(diào)控基因的表達(dá)［5］。研究表明，miRNA 能影響病毒的復(fù)制，主要是miRNA 可靶向病毒基因組或調(diào)控宿主抗病毒反應(yīng)。學(xué)者通過探索與PRRSV 相關(guān)的microRNA 來揭示其致病機(jī)制，以此來取得更新、更好治療PRRS 的策略［6-10］。對有關(guān)miRNA 調(diào)控PRRSV 作用的研究進(jìn)行闡述，為PRRSV 的防控研究提供科學(xué)指導(dǎo)，對制定合理的免疫程序以及開發(fā)PRRSV 疫苗具有重要意義。

1 miRNA 的調(diào)控作用

研究表明，宿主細(xì)胞編碼的miRNA 在各種免疫細(xì)胞的產(chǎn)生、增殖、發(fā)育以及免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在T 細(xì)胞增殖過程中，miR-142-3p 可以與跨膜蛋白GARP（Glycoprotein A repetitions predominant）的3'端高度保守的miRNA 結(jié)合區(qū)域結(jié)合，通過調(diào)節(jié)GARP 的表達(dá)來控制CD4+T 細(xì)胞的增殖［11］。在B 細(xì)胞的發(fā)育和凋亡過程中，miR-34a 和miR-17-92 簇可以分別通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Foxp1 和促凋亡蛋白Bim，抑制B 祖細(xì)胞向前體B 細(xì)胞發(fā)育［12］。同時，宿主細(xì)胞編碼的miRNA 還能通過干擾病毒復(fù)制因子，調(diào)控病毒復(fù)制及染毒細(xì)胞凋亡來影響病毒增殖。如miR-340-5p 可以影響HBV 的復(fù)制［13］，miR-325-3p 能 抑 制HBV 的 復(fù) 制［14］，miR-211-5p 能夠促進(jìn)HBV 的復(fù)制［15］；miR-34a 能抑制AIV 病毒的復(fù)制［16］，而miR-29c 在AIV 的誘導(dǎo)下能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程［17］。gga-miR-445-5p、miR-375 能夠抑制NDV 的復(fù)制［18，19］。隨著miRNA 的病毒調(diào)控作用方面研究的深入，尤其是在豬病毒疾病的研究中，與PRRSV 相關(guān)的miRNA 也陸續(xù)被挖掘，PRRSV 作為單股正鏈RNA 病毒，其基因組含有較長的非編碼區(qū)，可以為microRNAs 發(fā)揮作用提供眾多靶點。不同的miRNA 可以通過不同的機(jī)制來調(diào)節(jié)PRRSV 入侵宿主的生物學(xué)過程［20］。

2 miRNA 對PRRSV 復(fù)制的調(diào)節(jié)

2.1 miRNA-4262 對PRRSV 復(fù)制的調(diào)控

CD163 是PRRSV 入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵受體。吳俊靜等［21］通過篩選和鑒定來獲得能夠調(diào)控CD163基因進(jìn)行翻譯表達(dá)的miRNA，并以此為基礎(chǔ)找到能很好抑制PRRSV 復(fù)制的miRNA。在此基礎(chǔ)上，通過試驗進(jìn)一步在細(xì)胞水平證實了miRNA-181c、miRNA-23b、miRNA-4262 能對PRRSV 的復(fù)制產(chǎn)生抑制效應(yīng)，其中miRNA-4262 的抑制效果最好。研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA-4262 也可調(diào)控CD169基因。CD163和CD169這2 個基因可能同時受miRNA-4262 靶向調(diào)控，從而提高了抑制PRRSV 復(fù)制的能力。

2.2 mir-3215和mir-let-7g對PRRSV復(fù)制的調(diào)控

為探討mir-3215 和mir-let-7g 和PRRSV 的 關(guān)系，鐘瑤［22］成功篩選到mir-3215 和mir-let-7g 靶向基因組保守區(qū)域位，設(shè)計特異性引物，選取不同的時間點，用qPCR 的方法檢測經(jīng)PRRSV 刺激后的Marc-145細(xì)胞，觀察對miRNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明，在感染早期，mir-3215 和mir-let-7g 表達(dá)受到抑制，但隨著時間延長，抑制情況減弱，36 h 左右mir-let-7g 先恢復(fù)到正常水平，而mir-3215 表達(dá)量要稍高一些，可能的原因是細(xì)胞內(nèi)mir-3215 表達(dá)代償性強(qiáng)。

2.3 let-7f-5p 對PRRSV 復(fù)制的調(diào)控

Reinhart 等［23］在秀麗隱桿線蟲里發(fā)現(xiàn)了let-7，它是一種能夠調(diào)節(jié)lin-41基因mRNA 表達(dá)的microRNA。此外，在果蠅和人類等有機(jī)體內(nèi)也證實存在let-7。研究表明，let-7 家族成員在對抗病原微生物的感染過程中起著重要作用。李娜［24］通過不同的引物設(shè)計、生物信息學(xué)軟件預(yù)測等方法，發(fā)現(xiàn)let-7f-5p 能夠和MYH9 3’UTR 的miRNA 特異性結(jié)合，發(fā)揮對MYH9 轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控作用，let-7f-5p 在PAMs被PRRSV 感染后表達(dá)水平有所下降，但是它的靶基因MYH9的表達(dá)水平有上升的趨勢。此外，在PAMs中進(jìn)行了let-7f-5p 模擬物的轉(zhuǎn)染試驗，將轉(zhuǎn)染終濃度設(shè)置為20、50、100 nmol/L，當(dāng)轉(zhuǎn)染100 nmol/L let-7f-5p 模擬物時，將其與對照組相比發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PRRSV 的病毒基因組拷貝數(shù)降低了83%，PRRSV ORF7 mRNA 降低了80%，抑制了MYH9 的表達(dá)，表明let-7f-5p 呈濃度梯度依賴性抑制PRRSV在PAMs中的復(fù)制。

2.4 miR-130b 對PRRSV 復(fù)制的調(diào)控

miR-130a、miR-130b、miR-301a、miR-301b 和miR-454 是miR-130 家族的5 個成員。李麗薇［25］在MARC-145 細(xì)胞上轉(zhuǎn)染miR-130 家族模擬體，結(jié)果顯示miR-130 可以抑制病毒復(fù)制。其中抑制作用最強(qiáng)的是miR-130b。以miR-130b 作為主要的研究對象，通過間接免疫熒光試驗驗證miR-130b 對PRRSV N 蛋白的影響，結(jié)果表明N 蛋白表達(dá)被miR-130b 所抑制。隨著miR-130b 轉(zhuǎn)染劑量的增加，其對PRRSV 抑制作用越明顯。

2.5 miR-10a-5p 對PRRSV 復(fù)制的調(diào)控

使用不同PRRSV 毒株感染宿主靶細(xì)胞PAMs，采用qRT-PCR 方法對PAM 中mir-10a-5p 水平進(jìn)行定量檢測，驗證了宿主靶細(xì)胞PAMs 中miR-10a-5p表達(dá)上調(diào)可通過不同PRRSV 毒株感染來進(jìn)行誘導(dǎo)；將前后轉(zhuǎn)染的miR-10a-5p mimics 用不同毒力的PRRSVs 進(jìn)行感染，結(jié)果顯示這2 種情況下過表達(dá)miR-10a-5p 均可抑制不同毒力PRRSVs 的復(fù)制，且效果顯著；此外，還對特異性表達(dá)SRP14 的腺病載體進(jìn)行了構(gòu)建，研究SRP14 對PRRSV 復(fù)制的影響，結(jié)果表明，為控制對PRRSV 的復(fù)制以及SRP14 的翻譯，可以使miR-10a-5p 與相應(yīng)的靶細(xì)胞結(jié)合，以此來識別SRP14，可有效抑制其表達(dá)，但會使PRRSV感染加速，導(dǎo)致SRP14 的表達(dá)能力降低，從而控制PRRSV 在PAMs的產(chǎn)生［26，27］。

2.6 miR-373和miR-24-3p對PRRSV復(fù)制的調(diào)控

miRNA 會對PRRSV 的復(fù)制起到促進(jìn)作用。陳靜［28］運用過表達(dá)miR-373 的模擬物（miR-373 mimic）或抑制miR-373 表達(dá)的抑制劑（miR-373 inhibitor）轉(zhuǎn) 染MARC-145 細(xì)胞 來檢 測PRRSV 的增 殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRRSV 滴度可以通過miR-373 模擬物來提高，細(xì)胞內(nèi)外的PRRSV RNA 和N 蛋白的表達(dá)水平上調(diào)；相反，PRRSV 滴度可以通過miR-373 抑制劑來降低，細(xì)胞內(nèi)外PRRSV 的RNA 和N 蛋白的表達(dá)水平下調(diào)。這表明，PRRSV 在MARC-145 細(xì)胞和PAMs 中的復(fù)制可以通過miR-373 來促進(jìn)。研究還發(fā)現(xiàn)，用抑制Sp1 表達(dá)和過表達(dá)Sp1 的質(zhì)粒先轉(zhuǎn)染MARC-145 細(xì)胞，再進(jìn)行感染PRRSV，說明通過抑制Sp1 也能抑制PRRSV 的RNA 水平，降低PRRSV滴度和下調(diào)PRRSV N 蛋白的表達(dá)水平，而過表達(dá)Sp1 則起到相反的作用。這表明Sp1 可以促進(jìn)PRRSV 復(fù)制。此外，用MARC-145 細(xì)胞共同轉(zhuǎn)染Sp1-Flag、miR-373 inhibitor 或形成各自對應(yīng)的對照，轉(zhuǎn)染后通過檢測PRRSV 增殖情況，結(jié)果表明Sp1促進(jìn)PRRSV 復(fù)制依賴于miR-373 的表達(dá)。

Xiao 等［29］研究PRRSV 感染仔豬肺組織的轉(zhuǎn)錄組變化時發(fā)現(xiàn)，PRRSV 感染后血紅素加氧酶1 基因（heme oxygenase 1，HO-1）顯著下調(diào)表達(dá)，與體外研究結(jié)果一致［30］。王雪［31］通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測并 驗 證 出miR-24-3p 是HO-1 的 靶miRNA，用PRRSV 感染MARC-145 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，miR-24-3p 的表達(dá)量顯著升高；在MARC-145 細(xì)胞中過表達(dá)miR-24-3p 發(fā) 現(xiàn)，HO-1 的表 達(dá)量 下 降而PRRSV 的 感染量上升，這說明HO-1 的表達(dá)受miR-24-3p 調(diào)控，且miR-24-3p 和HO-1 的關(guān)系呈負(fù)相關(guān)。

3 小結(jié)

在病毒與宿主的對抗中，細(xì)胞運用多重障礙以及自身的免疫防御來阻止病毒的入侵，但在長期進(jìn)化過程中，病毒為了能順利進(jìn)入細(xì)胞，完成復(fù)制增殖和傳播一系列過程［32-34］，采取各種策略來建立有利于感染的環(huán)境。miRNA 既可以靶向作用病毒入侵的細(xì)胞關(guān)鍵因子［35，36］，也可以直接作用于病毒基因組，其在病毒與宿主的互作中扮演著重要的角色［37，38］。隨著miRNA 研究的不斷深入，宿主miRNA 如何調(diào)控PRRSV 的復(fù)制也將更清晰，PRRSV 疫苗的成功開發(fā)也將指日可待。