葛麗紅,趙 津,王永興,趙國洪,楊鎖柱,王正虹,王洪偉
(1.玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,云南省玉溪市畜禽疫病檢測重點實驗室,云南 玉溪 653106;2.玉溪云興獸藥經(jīng)營部,云南 玉溪 653100)
玉溪市一林下放養(yǎng)土雜雞場飼養(yǎng)土雜雞1 500 只,2021 年6 月陸續(xù)有25 日齡左右的雞出現(xiàn)精神沉郁,羽毛蓬松,食欲不振,腹瀉,血便,部分雞只死亡等現(xiàn)象。通過對病雞進行病理剖檢、蟲卵檢查、蟲卵計數(shù)、特異性引物PCR 擴增及蟲種18S rRNA 基因序列分析,確定病雞寄生蟲的感染情況和感染程度,為本病的有效防控提供依據(jù)。
1.1 采樣 對發(fā)生血便癥狀的病雞進行病理剖檢,采集盲腸內(nèi)容物和血便,冷凍保存,用于后續(xù)檢測。
1.2 主要試劑及蟲株 蛋白酶K、SDS、Tris 飽和酚等試劑購自生工生物工程(上海)有限公司,Marker購自廣州東勝生物科技有限公司,PCRmix購自北京艾德萊生物科技有限公司;含有柔嫩艾美耳球蟲PTMZ株的雞球蟲病四價活疫苗購自正典生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。
1.3 蟲卵檢查 參照國標(biāo)《動物球蟲病診斷技術(shù)》[8]進行。
1.3.1 定性檢查 采集雞群的新鮮混合糞便樣品500 g,取10 g 放入燒杯,加50 mL 蒸餾水混勻,用60 目篩子過濾3 次。濾液以2 500 r/min 離心10 min,棄上清,沉淀用飽和食鹽水沖洗3 次,靜置5 min,取上層液在40×10倍顯微鏡下觀察。
部分新鮮糞便放置于28 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,采用飽和食鹽水漂浮法處理后,在100×10倍顯微鏡下觀察。
1.3.2 定量檢查 稱取2 g 糞便樣品用蒸餾水混勻,用60目篩子過濾3次,濾液以2 500 r/min離心10 min,棄上清,沉淀用飽和食鹽水沖洗3 次,補加飽和食鹽水至60 mL,搖勻,靜置5 min。用移液槍吸取上層液注滿麥?zhǔn)嫌嫈?shù)板,靜置5 min,于40×10倍鏡下測量蟲卵大小,同時進行蟲卵計數(shù)。
1.4 樣品DNA 的提取 取糞便樣品0.2 g,用1 mL 雙蒸水混勻制成卵囊液。取卵囊液500 μL于-20℃超低溫冰箱中反復(fù)凍融3次,每次20min;最后一次解凍后加入400 μL Tris 飽和酚、60 μL SDS、25 μL 蛋白酶K,振搖,置37 ℃培養(yǎng)箱過夜;加500μL Tris飽和酚,振搖,1200r/min離心5min;取上清液加200 μL Tris飽和酚和200 μL 氯仿,振搖,1 200 r/min 離心5 min;取上清液加400 μL氯仿振搖,1 200 r/min離心5 min;取上清液加800 μL 無水乙醇和40 μL NaAc(醋酸鈉)混勻,-20 ℃下冷凍0.5 h取出,1 200 r/min離心10 min,棄上清,吹干;加400 μL 70%乙醇洗滌沉淀,1 200 r/min 離心10 min,棄上清,吹干;把沉淀溶解于40 μL雙蒸水中備用。
1.5 樣品DNA 特異性擴增 按行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[2-3]進行。將柔嫩艾美耳球蟲分型檢測引物送上海生工合成,引物序列見表1。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳,30 min后觀察擴增結(jié)果。
表1 柔嫩艾美耳球蟲PCR擴增基因引物
1.6 雞球蟲18S rRNA 基因序列分析 將樣品DNA 送上海生工進行18S rRNA 基因序列測序。應(yīng)用MegAlign 分析軟件,對檢測到的蟲株18S rRNA 序列與GenBank 上公布的不同種球蟲的18S rRNA 序列進行遺傳進化分析[4-5],相關(guān)蟲種信息見表2。
表2 不同種球蟲的18S rRNA序列信息
2.1 病理剖檢結(jié)果 解剖發(fā)現(xiàn)病雞盲腸粗大腫脹,剪開腸腔,內(nèi)有棕黑色黏液樣內(nèi)容物流出,其他組織器官無肉眼可見病變(圖1)。
圖1 盲腸病變
2.2 蟲卵檢查結(jié)果
2.2.1 定性檢查 糞便樣品通過飽和食鹽水漂浮法處理后,鏡檢(400×)發(fā)現(xiàn)大量卵圓形蟲卵;糞便經(jīng)28 ℃培養(yǎng)并經(jīng)漂浮法處理后,鏡檢(1 000×)發(fā)現(xiàn)每個孢子化卵囊含4 個孢子囊,每個孢子囊含有2個子孢子。
2.2.2 定量檢查 在顯微鏡(400×)視野下進行蟲卵大小測量和計數(shù),得出球蟲卵長度在22.922~26.621 μm,寬度在17.433~19.631 μm(表3),大小和柔嫩艾美耳球蟲接近;兩個計數(shù)室三次重復(fù)的平均蟲卵數(shù)為85 個(表4)。根據(jù)國標(biāo)里的計算公式計算出每克糞便中的卵囊數(shù)(OPG),OPG=A×200=85×200=1.7×104。
表3 球蟲卵囊大小 μm
表4 計數(shù)室內(nèi)平均蟲卵數(shù) 個
2.3 雞球蟲基因組PCR檢測 用柔嫩艾美耳球蟲特異性引物對糞樣DNA進行PCR擴增,結(jié)果樣品與陽性對照均得到463 bp 的特異性目的條帶(圖2)。
圖2 臨床樣品PCR檢測結(jié)果
2.4 雞球蟲18S rRNA基因序列分析結(jié)果 對該球蟲18S rRNA 序列進行BLAST 比對分析,用MEGA11 分析軟件和鄰接法(NJ 法)對該序列與GenBank 上公布的不同種球蟲的18S rRNA 序列進行遺傳進化分析,繪制進化樹。結(jié)果顯示:該球蟲與GenBank 公布的7 株柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)的同源性最高,為99.61%~99.92%,且在進化樹上構(gòu)成一個分支;同時,毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲的親緣關(guān)系最近,構(gòu)成一個分支。
通過流行病學(xué)、病理癥狀、蟲卵檢查初步判斷該病例為球蟲感染,進一步通過柔嫩艾美耳球蟲特異性引物PCR擴增、18S rRNA基因測序及遺傳進化分析確定該球蟲種為柔嫩艾美耳球蟲,且與上海分離蟲株(DQ136176)的同源性最高,達(dá)到99.92%。同時,毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲的親緣關(guān)系最近,構(gòu)成一個分支。這與蔡蘭等[5]報道的結(jié)果相一致,二者生物學(xué)特性相似,都在盲腸發(fā)育成卵囊,而且是致病力最強的種。
通過蟲卵計數(shù)計算出該病例每克糞便卵囊數(shù)(OPG)為1.7×104。根據(jù)國標(biāo)判定標(biāo)準(zhǔn)[1],判定該病例為中度感染。給養(yǎng)殖戶建議采取“給藥-停藥-再給藥”的方式全群投藥[6],用磺胺類藥物加祛濕中藥連用3 d,停3 d,再連用3 d。給藥一個周期后,取糞便檢測,視野內(nèi)的卵囊數(shù)明顯減少。證明該治療方法具有顯著療效。
散養(yǎng)雞由于活動范圍廣,糞便多散落在土壤中,而土壤是包括球蟲在內(nèi)的很多寄生蟲的溫床,散養(yǎng)雞更容易接觸到土壤,因此感染球蟲等土源性寄生蟲的概率大增[7]。預(yù)防建議:下批雞群應(yīng)重新劃定圈養(yǎng)地,以防糞便殘留引起循環(huán)感染;雞群產(chǎn)生的糞便要統(tǒng)一收集進行發(fā)酵處理或太陽暴曬處理后再使用,以減少交叉感染[8];在保證原場地表層土壤安全的情況下采取煉火土方式焚燒,殺死殘留蟲卵;采用疫苗預(yù)防,接種四價球蟲苗的效果較好[9]。