葛麗紅，趙 津，王永興，趙國(guó)洪，楊鎖柱，王正虹，王洪偉

（1.玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南省玉溪市畜禽疫病檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 玉溪 653106；2.玉溪云興獸藥經(jīng)營(yíng)部，云南 玉溪 653100）

玉溪市一林下放養(yǎng)土雜雞場(chǎng)飼養(yǎng)土雜雞1 500 只，2021 年6 月陸續(xù)有25 日齡左右的雞出現(xiàn)精神沉郁，羽毛蓬松，食欲不振，腹瀉，血便，部分雞只死亡等現(xiàn)象。通過(guò)對(duì)病雞進(jìn)行病理剖檢、蟲(chóng)卵檢查、蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)、特異性引物PCR 擴(kuò)增及蟲(chóng)種18S rRNA 基因序列分析，確定病雞寄生蟲(chóng)的感染情況和感染程度，為本病的有效防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣 對(duì)發(fā)生血便癥狀的病雞進(jìn)行病理剖檢，采集盲腸內(nèi)容物和血便，冷凍保存，用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2 主要試劑及蟲(chóng)株 蛋白酶K、SDS、Tris 飽和酚等試劑購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司，Marker購(gòu)自廣州東勝生物科技有限公司，PCRmix購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；含有柔嫩艾美耳球蟲(chóng)PTMZ株的雞球蟲(chóng)病四價(jià)活疫苗購(gòu)自正典生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 蟲(chóng)卵檢查 參照國(guó)標(biāo)《動(dòng)物球蟲(chóng)病診斷技術(shù)》［8］進(jìn)行。

1.3.1 定性檢查 采集雞群的新鮮混合糞便樣品500 g，取10 g 放入燒杯，加50 mL 蒸餾水混勻，用60 目篩子過(guò)濾3 次。濾液以2 500 r/min 離心10 min，棄上清，沉淀用飽和食鹽水沖洗3 次，靜置5 min，取上層液在40×10倍顯微鏡下觀察。

部分新鮮糞便放置于28 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，采用飽和食鹽水漂浮法處理后，在100×10倍顯微鏡下觀察。

1.3.2 定量檢查 稱取2 g 糞便樣品用蒸餾水混勻，用60目篩子過(guò)濾3次，濾液以2 500 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用飽和食鹽水沖洗3 次，補(bǔ)加飽和食鹽水至60 mL，搖勻，靜置5 min。用移液槍吸取上層液注滿麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)板，靜置5 min，于40×10倍鏡下測(cè)量蟲(chóng)卵大小，同時(shí)進(jìn)行蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)。

1.4 樣品DNA 的提取 取糞便樣品0.2 g，用1 mL 雙蒸水混勻制成卵囊液。取卵囊液500 μL于－20℃超低溫冰箱中反復(fù)凍融3次，每次20min；最后一次解凍后加入400 μL Tris 飽和酚、60 μL SDS、25 μL 蛋白酶K，振搖，置37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜；加500μL Tris飽和酚，振搖，1200r/min離心5min；取上清液加200 μL Tris飽和酚和200 μL 氯仿，振搖，1 200 r/min 離心5 min；取上清液加400 μL氯仿振搖，1 200 r/min離心5 min；取上清液加800 μL 無(wú)水乙醇和40 μL NaAc（醋酸鈉）混勻，－20 ℃下冷凍0.5 h取出，1 200 r/min離心10 min，棄上清，吹干；加400 μL 70%乙醇洗滌沉淀，1 200 r/min 離心10 min，棄上清，吹干；把沉淀溶解于40 μL雙蒸水中備用。

1.5 樣品DNA 特異性擴(kuò)增 按行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［2-3］進(jìn)行。將柔嫩艾美耳球蟲(chóng)分型檢測(cè)引物送上海生工合成，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，30 min后觀察擴(kuò)增結(jié)果。

表1 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)PCR擴(kuò)增基因引物

1.6 雞球蟲(chóng)18S rRNA 基因序列分析 將樣品DNA 送上海生工進(jìn)行18S rRNA 基因序列測(cè)序。應(yīng)用MegAlign 分析軟件，對(duì)檢測(cè)到的蟲(chóng)株18S rRNA 序列與GenBank 上公布的不同種球蟲(chóng)的18S rRNA 序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析［4-5］，相關(guān)蟲(chóng)種信息見(jiàn)表2。

表2 不同種球蟲(chóng)的18S rRNA序列信息

2 結(jié)果與分析

2.1 病理剖檢結(jié)果 解剖發(fā)現(xiàn)病雞盲腸粗大腫脹，剪開(kāi)腸腔，內(nèi)有棕黑色黏液樣內(nèi)容物流出，其他組織器官無(wú)肉眼可見(jiàn)病變（圖1）。

圖1 盲腸病變

2.2 蟲(chóng)卵檢查結(jié)果

2.2.1 定性檢查 糞便樣品通過(guò)飽和食鹽水漂浮法處理后，鏡檢（400×）發(fā)現(xiàn)大量卵圓形蟲(chóng)卵；糞便經(jīng)28 ℃培養(yǎng)并經(jīng)漂浮法處理后，鏡檢（1 000×）發(fā)現(xiàn)每個(gè)孢子化卵囊含4 個(gè)孢子囊，每個(gè)孢子囊含有2個(gè)子孢子。

2.2.2 定量檢查 在顯微鏡（400×）視野下進(jìn)行蟲(chóng)卵大小測(cè)量和計(jì)數(shù)，得出球蟲(chóng)卵長(zhǎng)度在22.922～26.621 μm，寬度在17.433～19.631 μm（表3），大小和柔嫩艾美耳球蟲(chóng)接近；兩個(gè)計(jì)數(shù)室三次重復(fù)的平均蟲(chóng)卵數(shù)為85 個(gè)（表4）。根據(jù)國(guó)標(biāo)里的計(jì)算公式計(jì)算出每克糞便中的卵囊數(shù)（OPG），OPG＝A×200＝85×200＝1.7×104。

表3 球蟲(chóng)卵囊大小 μm

表4 計(jì)數(shù)室內(nèi)平均蟲(chóng)卵數(shù) 個(gè)

2.3 雞球蟲(chóng)基因組PCR檢測(cè) 用柔嫩艾美耳球蟲(chóng)特異性引物對(duì)糞樣DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果樣品與陽(yáng)性對(duì)照均得到463 bp 的特異性目的條帶（圖2）。

圖2 臨床樣品PCR檢測(cè)結(jié)果

2.4 雞球蟲(chóng)18S rRNA基因序列分析結(jié)果 對(duì)該球蟲(chóng)18S rRNA 序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，用MEGA11 分析軟件和鄰接法（NJ 法）對(duì)該序列與GenBank 上公布的不同種球蟲(chóng)的18S rRNA 序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，繪制進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示：該球蟲(chóng)與GenBank 公布的7 株柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（E.tenella）的同源性最高，為99.61%～99.92%，且在進(jìn)化樹(shù)上構(gòu)成一個(gè)分支；同時(shí)，毒害艾美耳球蟲(chóng)與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的親緣關(guān)系最近，構(gòu)成一個(gè)分支。

3 結(jié)論與分析

通過(guò)流行病學(xué)、病理癥狀、蟲(chóng)卵檢查初步判斷該病例為球蟲(chóng)感染，進(jìn)一步通過(guò)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)特異性引物PCR擴(kuò)增、18S rRNA基因測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析確定該球蟲(chóng)種為柔嫩艾美耳球蟲(chóng)，且與上海分離蟲(chóng)株（DQ136176）的同源性最高，達(dá)到99.92%。同時(shí)，毒害艾美耳球蟲(chóng)與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的親緣關(guān)系最近，構(gòu)成一個(gè)分支。這與蔡蘭等［5］報(bào)道的結(jié)果相一致，二者生物學(xué)特性相似，都在盲腸發(fā)育成卵囊，而且是致病力最強(qiáng)的種。

通過(guò)蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)計(jì)算出該病例每克糞便卵囊數(shù)（OPG）為1.7×104。根據(jù)國(guó)標(biāo)判定標(biāo)準(zhǔn)［1］，判定該病例為中度感染。給養(yǎng)殖戶建議采取“給藥-停藥-再給藥”的方式全群投藥［6］，用磺胺類藥物加祛濕中藥連用3 d，停3 d，再連用3 d。給藥一個(gè)周期后，取糞便檢測(cè)，視野內(nèi)的卵囊數(shù)明顯減少。證明該治療方法具有顯著療效。

散養(yǎng)雞由于活動(dòng)范圍廣，糞便多散落在土壤中，而土壤是包括球蟲(chóng)在內(nèi)的很多寄生蟲(chóng)的溫床，散養(yǎng)雞更容易接觸到土壤，因此感染球蟲(chóng)等土源性寄生蟲(chóng)的概率大增［7］。預(yù)防建議：下批雞群應(yīng)重新劃定圈養(yǎng)地，以防糞便殘留引起循環(huán)感染；雞群產(chǎn)生的糞便要統(tǒng)一收集進(jìn)行發(fā)酵處理或太陽(yáng)暴曬處理后再使用，以減少交叉感染［8］；在保證原場(chǎng)地表層土壤安全的情況下采取煉火土方式焚燒，殺死殘留蟲(chóng)卵；采用疫苗預(yù)防，接種四價(jià)球蟲(chóng)苗的效果較好［9］。