陸巍 廉吉虎 王瀟然 高慶圓 劉炳辰 杜杉杉
前列腺癌是泌尿外科常見腫瘤之一,也是影響男性健康與生活質量的惡性腫瘤。針對早期前列腺癌目前臨床的首選治療方案主要為手術病灶切除治療,而化療則為晚期前列腺癌的主要治療方式。統(tǒng)計大量臨床腫瘤病例隨訪資料可知:長期化療給晚期癌癥患者帶來大量的毒副反應和經(jīng)濟負擔,因此找尋更安全與更經(jīng)濟的抗癌藥物是目前腫瘤領域所面臨的重要問題及重要挑戰(zhàn)。黃連素,又名小檗堿,是中藥黃連的主要活性成分。近來研究[1]發(fā)現(xiàn)黃連素在多種心內(nèi)血管疾病、糖尿病及抗腫瘤治療中均有著較好的臨床應用價值。黃連素作為一種傳統(tǒng)的抗炎藥,能否通過抑制惡性腫瘤誘導的宿主炎癥反應進而抑制腫瘤的進展是目前臨床研究的一大熱點。與傳統(tǒng)的一些化療藥物進行比較,天然化合物黃連素具有安全性更高、更經(jīng)濟的特點,其在前列腺癌治療方面的應用亟待探索。目前,國內(nèi)外多項研究[2,3]對黃連素的認知僅停留在細胞水平和分子水平上,本文以前列腺癌細胞株PC-3 為研究對象,分析黃連素的抗腫瘤作用及機制,為臨床抗腫瘤輔助藥物的研發(fā)提供新的思路、方法及依據(jù)。
1.1 材料
1.1.1 細胞株 人前列腺癌PC-3 細胞株從美國模式培養(yǎng)物保藏所獲得(馬納薩斯,維吉尼亞州,美國),并在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)(Hyclone 公司,洛根,猶他州,美國)。
1.1.2 藥物 黃連素購自西馬-奧爾德里奇(路易斯,密蘇里州,美國)。黃連素的純度≥98%,溶解于二甲亞砜中(σ-奧爾德里奇),稀釋至實驗所需濃度。
1.2 方法
1.2.1 細胞增殖抑制實驗 采用MTT 法:選取處于對數(shù)生長期的前列腺癌PC-3 細胞株,將所有細胞株放置于DMEM 培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),培養(yǎng)基環(huán)境為在5%的CO2中添加10%的胎牛血清。當細胞密度達到70%時,添加不同濃度的黃連素來對細胞進行處理。在黃連素組中,前列腺癌PC-3 細胞株在5、10、20、50 μM的黃連素中培養(yǎng)24 h,在未加入黃連素組中,列腺癌PC-3 細胞株在不加黃連素中培養(yǎng)24 h。細胞的存活率通過MTT 試驗進行測量。細胞96 孔板在酶標儀上讀取(賽默科技,羅克福德,伊利諾伊州,美國),測試波長為490 nm,參考波長為570 nm,在波長490 nm 處測吸光度(A),光密度(OD),以上各組實驗重復3 次。抑制率(%)=(1-實驗組A 值/對照組A 值)×100%。
1.2.2 前列腺癌PC-3 細胞株凋亡率 采用流式細胞術(FCM)進行檢測:根據(jù)制造商的說明書以碘化酸/丙酸碘化(PI)雙染色法進行檢測(Santa Cruz 生物技術公司,Santa Cruz,加利福尼亞州,美國)。用磷酸-緩沖鹽水沖洗細胞,用不同濃度的黃連素(5、10、20、50 μM)處理細胞24 或48 h,隨后在結合緩沖液(10 mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸-氫氧化鈉,pH 值7.4;25 mM氯化鈣和144 mM 氯化鈉)中進行再懸浮。隨后,加入膜聯(lián)蛋白V(0.1 μg/μl)和PI(0.05 μg/μl)染料,并將細胞在冰中、黑暗下培養(yǎng)30 min。然后將細胞進行熒光活化細胞分類(FASS)分析;樣品由流式細胞儀細胞分選系統(tǒng)(BD 生物科技,圣何塞,加利福尼亞州,美國)進行檢測,最后進行凋亡率的計算分析。
1.2.3 前列腺癌PC-3 細胞株周期檢測 前列腺癌PC-3 細胞株處理好以后所有黃連素加入濃度均為20 μM,實驗分組為:對照組(藥物孵育0 h);藥物孵育24 h、藥物孵育48 h;藥物孵育72 h。每組3個復孔。然后進行收集細胞、洗滌并固定細胞、染色孵育,最后進行流式檢測和結果分析。結果數(shù)據(jù)采用Flowjo 軟件進行。
1.2.4 前列腺癌PC-3 細胞株中FAS 蛋白的表達測定測定步驟為首先進行蛋白印記(所有前列腺癌PC-3細胞株處理好以后在不同時間點加入黃連素,探究黃連素不同濃度對蛋白表達的影響,則在相同時間內(nèi)加入不同濃度的黃連素,各實驗組黃連素的終濃度為 5、10、20、50 μM,另外設對照組,加入相同體積的藥物溶解介質,所有標本均放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)26 h。)、其次所有培養(yǎng)標本進行細胞總蛋白提取、蛋白定量的測定、制膠、電泳、轉膜,進行免疫反應,然后進行顯影和定影,采用蛋白免疫印跡(WB)方法檢測前列腺癌PC-3 細胞株中FAS 蛋白的表達,最后進行數(shù)據(jù)處理和圖片分析,掃描下保存的圖片采用Image J分析軟件進行灰度分析。
1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差()表示,采用t檢驗。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 不同濃度黃連素對前列腺癌PC-3 細胞株增殖抑制率、凋亡率的影響 黃連素組前列腺癌PC-3 細胞株增殖抑制率及凋亡率均高于未加入黃連素組,且隨著黃連素濃度的上升,前列腺癌PC-3 細胞株增殖抑制率及凋亡率均逐漸升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。
表1 不同濃度黃連素對前列腺癌PC-3 細胞株增殖抑制率、凋亡率的影響(,%)
表1 不同濃度黃連素對前列腺癌PC-3 細胞株增殖抑制率、凋亡率的影響(,%)
注:與未加入黃連素組比較,aP<0.05;與5 μM 比較,bP<0.05;與10 μM 比較,cP<0.05;與20 μM 比較,dP<0.05
2.2 黃連素孵育時間對前列腺癌PC-3 細胞株細胞周期的影響 黃連素孵育24 h組、黃連素孵育48 h組、黃連素孵育72 h組的前列腺癌PC-3 細胞株在G0/G1期比例高于對照組,在S 期與G2/M 期比例低于對照組,且隨黃連素孵育時間增加,前列腺癌PC-3 細胞株在G0/G1期比例明顯增加,在S 期與G2/M 期比例逐漸降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。
表2 黃連素孵育時間對前列腺癌PC-3 細胞株細胞周期的影響(,%)
表2 黃連素孵育時間對前列腺癌PC-3 細胞株細胞周期的影響(,%)
注:各組比較,P<0.05
2.3 同濃度黃連素不同孵育時間對前列腺癌PC-3 細胞株中FAS 蛋白的影響 在加入固定濃度20 μM 黃連素進行藥物孵育中,隨著孵育時間的延長,前列腺癌PC-3 細胞株中FAS 蛋白濃度逐漸降低。見圖1。
圖1 不同孵育時間對前列腺癌PC-3 細胞株中FAS 蛋白的影響
2.4 不同濃度黃連素孵育相同時間對前列腺癌PC-3 細胞株中FAS 蛋白的影響 在孵育相同時間前提下,加入黃連素前后列腺癌PC-3 細胞株中FAS 蛋白顯著降低,且隨著濃度的增高,FAS 蛋白呈逐漸降低。見圖2。
圖2 不同濃度黃連素對前列腺癌PC-3 細胞株中FAS 蛋白的影響
黃連素是一種穩(wěn)定存在的季銨型異喹啉類生物堿,目前臨床上主要用于治療腸道感染[4]。多項研究表明[5-7],在腫瘤細胞周期停滯與細胞的凋亡過程中,黃連素可能通過上調(diào)周期蛋白激酶抑制因子與下調(diào)一系列周期蛋白依賴的激酶以及周期蛋白起著一定的誘導作用。2010年,有相關文獻[8]指出:低濃度黃連素能夠通過誘導DNA 損傷(DNA 雙鏈斷裂即DSB),激活p53-p21 通路導致人成骨肉瘤U2OS 細胞發(fā)生G1期停滯,而較高濃度的黃連素(50 μg/ml)則能誘導G2/M 期停滯,但黃連素誘導的G2/M 期停滯并不依賴p53-p21通路。此前,研究證實[9]黃連素可通過下調(diào)FAS、CDK1、細胞周期蛋白B1、CDC25C 以及上調(diào)Weel、14-3-3σ 的表達,誘導其他幾種腫瘤細胞發(fā)生G2/M 期停滯,但具體的上游信號通路還不清楚。
本研究以人前列腺癌PC-3 細胞株為細胞模型,結果顯示:黃連素組前列腺癌PC-3 細胞株增殖抑制率及凋亡率均高于對照組,且隨著黃連素濃度的上升,前列腺癌PC-3 細胞株增殖抑制率及凋亡率均逐漸升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示,黃連素對前列腺癌PC-3 細胞株具有顯著的抑制增殖作用,另一方面,加入20 μM 黃連素處理后,黃連素孵育24 h組、黃連素孵育48 h組、黃連素孵育72 h組的前列腺癌PC-3細胞株在G0/G1期比例高于對照組,在S 期與G2/M 期比例低于對照組,且隨黃連素孵育時間增加,前列腺癌PC-3 細胞株在G0/G1期比例明顯增加,在S 期與G2/M 期比例逐漸降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。由此提示:黃連素對前列腺癌PC-3 細胞株細胞周期的分布具有顯著的影響,尤其是高濃度時可明顯阻滯G2/M 期。脂肪酸合FAS 屬于大分子蛋白復合物的一種,主要存在于機體的細胞質內(nèi),在生物體內(nèi)源性脂肪酸的合成中有著至為關鍵的作用[10]。而有相關文獻提出[11,12]:FAS 在肥胖者的肝臟、脂肪細胞及各腫瘤細胞中都呈現(xiàn)出異常高表達,且FAS 的表達與預后呈負相關存在,表達越高提示預后不良風險越高。而本研究進一步行WB 檢測分析得,黃連素不同孵育時間及不同濃度均對前列腺癌PC-3 細胞株中FAS 蛋白存在影響,且隨著孵育時間的延長與濃度的增加,FAS 蛋白含量均逐漸減少,考慮原因可能為:黃連素通過抑制FAS 中β 原酮脂酰合成酶從而對DNA 的復制起到了抑制作用,阻斷了腫瘤細胞生長的能量來源,誘導細胞凋亡,進而抑制了細胞的增殖與生長。
綜上所述,黃連素可促進前列腺癌細胞株PC-3 的細胞凋亡,通過改變細胞周期抑制其增殖生長,具有抗腫瘤活性,而促進細胞凋亡和抑制增長生長可能與引起細胞G2/M 期阻滯和抑制前列腺癌PC-3 細胞株中FAS 蛋白表達有關。但關于FAS 蛋白或其蛋白通路與細胞G2/M 期阻滯之間的聯(lián)系還有待進一步深入研究。