許穎，付紀源，王雨情，吳健，劉冰，陳寧，于蕾，劉穎杰，李文蘭※

（1.哈爾濱商業(yè)大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076）

胃癌是世界上第四大常見癌癥和第二大常見癌癥死亡原因，在東亞、東歐和中南美洲部分地區(qū)，胃癌的發(fā)病率特別高[1]。在中國，每年新診斷出來的胃癌患者逐年遞增，對公共健康已經(jīng)構(gòu)成了嚴重的威脅[2]。胃癌是由多種病因?qū)е碌囊环N疾病，發(fā)病機制非常復雜，研發(fā)新的腫瘤治療技術(shù)和方法迫在眉睫。中藥在治療惡性腫瘤上具有治療效果好、副作用小等優(yōu)勢，所以開發(fā)具有治療惡性腫瘤作用的中藥是非常有必要的。

赤芍（Radix paeoniae Rubra）為毛茛科（Ranunculaceae）植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）或川赤芍（Paeonia veitchii Lynch）的干燥根[3]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》列芍藥為中品[4]，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載芍藥的功效為“味苦平主邪氣腹痛，除血痹，破堅積，寒熱，疝瘕，止痛，利小便，益氣”[5]。在現(xiàn)代臨床醫(yī)學中，赤芍在治療腫瘤方面也有顯著效果[6-10]。其中在治療胃癌方面，Wang等[11]發(fā)現(xiàn)赤芍中的活性成分可通過抑制胃癌相關(guān)成纖維細胞的侵襲和遷移能力，從而阻止成纖維細胞激活胃癌細胞的相關(guān)信號通路，達到抗腫瘤的目的。由此可見，中藥赤芍作為抗胃癌藥物具有良好的應(yīng)用前景。目前，對于中藥赤芍抗胃癌的活性成分及其作用機制的研究尚不完整。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)，通過挖掘主要靶點及相關(guān)通路，構(gòu)建中藥赤芍的活性成分與胃癌疾病靶點的相互作用網(wǎng)絡(luò)，闡明赤芍抗胃癌潛在的作用機制，從而為研究中藥赤芍的抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫、軟件及在線網(wǎng)站

中藥系統(tǒng)藥理學分析數(shù)據(jù)庫TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php/）；String數(shù)據(jù)庫（https://stringdb.org/）；UniProt數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）；Pub-Chem數(shù) 據(jù) 庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；OMIM（http://www.omim.org/）；PharmMapper數(shù)據(jù)庫（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）；GeneCard數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）；DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）；PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)；Cytoscape 3.7.2軟件；AutoDockTools 1.5.6軟件；Python 2.5.0軟件；PyMOL 2.3.0軟件；OpenBabel 3.1.1軟件；微生信在線網(wǎng)站（http://www.bioinformatics.com.cn/）。

1.2 赤芍活性成分及其靶點的篩選

通過檢索TCMSP[12]數(shù)據(jù)庫，以口服生物利用度OB≥30%、類藥性DL≥0.18為篩選依據(jù)，獲得赤芍的活性成分及相應(yīng)靶點，并通過查閱相關(guān)文獻對其進行補充來篩選赤芍活性化合物，在PubChem數(shù)據(jù)庫中下載對應(yīng)活性化合物的SDF文件，導入PharmMapper[13]數(shù)據(jù)庫中，選取標準擬合分數(shù)在0.98以上的靶點，對赤芍活性成分的靶點進行補充，并利用Uniport[14]數(shù)據(jù)庫在限定基因來源為“homo sapiens”的前提下將預測的靶點名稱轉(zhuǎn)化為基因名。

1.3 胃癌疾病靶點的篩選

通過在OMIM和GeneCard[15]數(shù)據(jù)庫中以“stomach cancer”和“gastric carcinoma”作為關(guān)鍵詞，對相關(guān)靶點進行檢索，去重后得到胃癌疾病靶點。其中在通過GeneCard數(shù)據(jù)庫收集靶點時，對檢索出的靶點評分取兩次中位數(shù)，選取大于兩次中位數(shù)評分的靶點作為胃癌疾病靶點。取赤芍成分靶點與疾病靶點的交集靶點，作為中藥赤芍抗胃癌的作用靶點。將赤芍成分和作用靶點共同導入Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建赤芍成分作用靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白 蛋白相互作用（PPI）的構(gòu)建

將交集靶點導入String[16]數(shù)據(jù)庫，物種選擇“homo sapiens”進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，下載“TSV”格式并導入到Cytoscape 3.7.2軟件中分析網(wǎng)絡(luò)，計算degree值的中位數(shù)，將degree值大于2倍中位數(shù)的靶點作為核心靶點。

1.5 GO及KEGG富集分析

將交集靶點導入DAVID[17]數(shù)據(jù)庫中，物種選擇“homo sapiens”進行GO富集（生物學過程：BP、細胞組分：CC和分子功能：MF）和KEGG通路分析，通過微生信在線工具網(wǎng)（http://www.bioinformatics.com.cn/）對結(jié)果進行可視化處理。將關(guān)鍵成分、交集靶點和通路共同導入Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建赤芍關(guān)鍵成分作用靶點 通路網(wǎng)絡(luò)。

1.6 分子對接

根據(jù)1.3項下利用Cytoscape 3.7.2軟件分析得到成分 作用靶點網(wǎng)絡(luò)，選取degree值大于中位數(shù)的成分作為對接配體，通過在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索下載“Mol2”格式文件。

將1.4項下篩選出的核心靶點，選取degree值前5的靶點作為分子對接的靶點蛋白，在PDB[18]數(shù)據(jù)庫中下載對接蛋白的3D結(jié)構(gòu)，以“pdb”格式保存，導入至PyMOL 2.3.0軟件對蛋白進行除水、除配體，再將其導入至AutoDock Tools 1.5.6軟件對蛋白進行加氫、計算電荷和設(shè)置原子類型，篩選的配體在Ligand項下進行“Detect Root”、“Choose Torsions”操作，經(jīng)過前處理的蛋白和配體在“Grid”項下設(shè)置對接范圍后開始進行對接，通過OpenBabel 3.1.1軟件將導出文件由“pdb”格式轉(zhuǎn)換為“pdbqt”格式，結(jié)果用PyMOL 2.3.0軟件進行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 赤芍活性成分及靶點的篩選

利用檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B（%）≥30，DL≥0.18進行篩選，確定了23個赤芍活性成分，并結(jié)合文獻檢索，得到8個具有明確抗腫瘤活性的成分，分別為Progallin A[19]、paeonol[20]、salicylic acid[21]、Methylgallate[22]、Sitogluside[23]、3,4,5-trihydroxybenzoic acid[24]、peonidin[25]和Oxypaeoniflorin[26]，最終共篩選到31個化合物，見表1。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和PharmMapper數(shù)據(jù)庫檢索，經(jīng)去重共檢索出212個赤芍活性成分相關(guān)靶點。

表1 中藥赤芍活性成分Table 1 Active components ofRubra

類藥性指數(shù)DL MOL001907 Progallin A 25.61 0.06 MOL000874 paeonol 28.79 0.04 MOL001801 salicylic acid 32.13 0.03 MOL001906 Methylgallate 30.91 0.05 MOL000357 Sitogluside 20.63 0.62 MOL000513 3,4,5-trihydroxybenzoic acid 31.69 0.04 MOL006765 peonidin 26.92 0.27 MOL007008 4-ethyl-paeoniflorin_qt 56.87 0.44 MOL005089 Oxypaeoniflorin 8.38 0.78 MOL001002 ellagic acid 43.06 0.43 MOL001918 paeoniforgenone 87.59 0.37 MOL001924 paeoniflorin 53.87 0.79 MOL001925 Paeoniflorin_qt 68.18 0.40 MOL002714 baicalein 33.52 0.21 MOL002776 Baicalin 40.12 0.75 MOL000358 beta-sitosterol 36.91 0.75 MOL000359 sitosterol 36.91 0.75 MOL004355 Spinasterol 42.98 0.76 MOL000449 Stigmasterol 43.83 0.76 MOL000492 (+)-catechin 54.83 0.24 MOL006992 (2R,3R)-4-methoxyl-distylin 59.98 0.30 MOL006999 Stigmast-7-en-3-ol 37.42 0.75 MOL007003 benzoyl paeoniflorin 31.14 0.54 MOL007004 Albiflorin 30.25 0.77 MOL007005 Albiflorin_qt 48.70 0.33 MOL007012 4-o-methyl-paeoniflorin_qt 56.70 0.43 MOL007014 8-debenzoylpaeonidanin 31.74 0.45 MOL007016 Paeoniflorigenone 65.33 0.37 MOL002883 Ethyl oleate(NF) 32.40 0.19 MOL005043 campest-5-en-3beta-ol 37.58 0.71 MOL001921 Lactiflorin 49.12 0.80標識Mol ID分子名稱Molecule Name口服生物利用度（%）OB

2.2 赤芍成分 靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選出的活性成分與成分靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件中，分析得到成分 作用靶點網(wǎng)絡(luò)，如圖1所示。該網(wǎng)絡(luò)共有533條邊和242個節(jié)點，其中橢圓形節(jié)點表示為赤芍活性成分，長方形節(jié)點表示成分靶點，節(jié)點顏色越深、形狀越大表示其degree值越高。由拓撲參數(shù)可得赤芍活性成分degree值的中位數(shù)為14，degree值大于14的成分有baicalein、beta-sitosterol、Stigmasterol、salicylic acid、paeonol、ellagic acid、Spinasterol、(+)-catechin、paeoniflorin、(2R,3R)-4-methoxyldistylin、Sitogluside、paeoniflorgenone、3,4,5-trihydroxybenzoic acid、Methylgallate和Progallin A。由此可見，中藥赤芍是通過多成分、多靶點相互作用來發(fā)揮作用的。

2.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）的構(gòu)建及分析

通過檢索OMIM和GeneCard數(shù)據(jù)庫，經(jīng)去重共獲得2 270個胃癌相關(guān)疾病靶點，其中與赤芍成分的共同靶點有102個，將102個交集靶點導入String數(shù)據(jù)庫，所得到的蛋白 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)中，共有1 606條邊和108個節(jié)點。結(jié)果利用Cytoscape 3.7.2軟件分析，度值中位數(shù)為26，以度值大于52為篩選條件，得到17個核心靶點，核心靶點及拓撲參數(shù)見表2。這些靶點之間的聯(lián)系更為緊密，推測這些靶點可能在赤芍治療胃癌疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

表2 核心靶點及拓撲參數(shù)Table 2 Core targets and topological parameters

2.4 GO及KEGG富集分析

將交集靶點通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO富集和KEGG通路分析。在GO富集分析結(jié)果中，共有230條生物過程條目（FDR＜0.05），其中包含167條BP（主要為對藥物的反應(yīng)、凋亡過程的負調(diào)控和細胞增殖的正調(diào)控等），25條CC（主要為細胞外間隙、胞質(zhì)、胞外區(qū)和膜筏等），38條MF（主要為酶結(jié)合、蛋白結(jié)合和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等），如圖2所示。在KEGG通路富集分析結(jié)果中，共分析得到了115條通路（FDR＜0.05），取排名前20的通路，如圖3所示。通路主要富集在癌癥通路，有45個靶點與其有密切聯(lián)系、31個靶點參與乙型肝炎通路、21個靶點參與美洲錐蟲病通路、21個靶點富集在TNF信號通路以及24個靶點參與甲型流感等。將篩選出的關(guān)鍵成分、潛在靶點及信號通路導入Cytoscape 3.7.2軟件中，分析得到關(guān)鍵成分 作用靶點 通路網(wǎng)絡(luò)，如圖4所示。其中圓形節(jié)點代表交集靶點，六邊形代表關(guān)鍵活性成分，“V”字形節(jié)點代表通路。

圖2 赤芍抗胃癌靶點GO富集分析Fig.2 GO enrichment analysis of anti-gastric cancer target ofRubra

圖3 赤芍抗胃癌的KEGG分析氣泡圖Fig.3 Bubble diagram of KEGG pathway analysis of traditional Chinese medicineRubra against gastric cancer

圖4 赤芍成分-靶點-通路相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Compounds-targets-pathways network ofRubra

2.5 分子對接

選擇赤芍成分 作用靶點中degree值大于中位數(shù)的成分與核心靶點排名前五的靶點ALB、AKT1、IL6、TP53和VEGFA通過AutoDock Tools 1.5.6軟件分別進行對接并打分，見表3。結(jié)果顯示，分子對接得分均小于0，說明對接的化合物與靶點都可以自發(fā)的結(jié)合。從表中可知，與排名前5的靶點對接，結(jié)合能小于﹣25.08 kJ mol-1的化合物有7個，分別為化合物paeoniflorgenone、(+)-catechin、Stigmasterol、salicylic acid、paeonol、Spinasterol和化合物beta-sitosterol。其中化合物Stigmasterol與TP53蛋白結(jié)合能力最強，分數(shù)為﹣8.27，化合物Stigmasterol與TP53蛋白結(jié)合時，可與TP53A氨基酸殘基PRO151形成氫鍵，與LEU201、ARG202、PRO219、TYR220及GLU221氨基酸殘基形成7個疏水鍵。如圖5所示，藍色部分為化合物Stigmasterol。

圖5 化合物Stigmasterol與TP53分子對接圖Fig.5 molecular docking diagram of compound Stigmasterol and TP53

表3 中藥赤芍成分與靶點分子對接結(jié)合情況Table 3 Docking and binding ofRubra components and target molecules

表3 中藥赤芍成分與靶點分子對接結(jié)合情況Table 3 Docking and binding ofRubra components and target molecules

成分 Ingredient 結(jié)合能（kJ mol-1） Binding energy AKT1 ALB IL6 TP53 VEGFA ellagic acid -24.06 -17.82 -23.47 -23.43 -23.39 paeoniflorgenone -25.27 -20.88 -20.75 -26.48 -24.85 Paeoniflorin -14.27 -6.65 -15.06 -20.13 -16.57 baicalein -4.10 -4.48 -3.89 -5.31 -3.93 beta-sitosterol -27.07 -19.33 -23.47 -29.54 -28.58 Spinasterol -24.77 -21.59 -27.57 -29.37 -28.41 Stigmasterol -28.33 -17.99 -25.48 -34.60 -32.26(+)-catechin -28.91 -18.07 -21.71 -24.39 -24.39(2R,3R)-4-methoxyl-distylin -20.67 -13.56 -210.76 -20.33 -19.87 3,4,5-trihydroxybenzoic acid -16.82 -14.64 -18.62 -22.84 -17.91 salicylic acid -20.17 -16.44 -17.66 -27.32 -19.12 paeonol -18.38 -18.53 -23.05 -29.21 -23.43 Sitogluside Methylgallate Progallin A-19.44 -13.04 -14.92 -20.31 -18.53-19.73 -18.91 -21.85 -26.23 -20.74-22.91 -13.04 -20.98 -24.54 -22.71

3 討論

在中醫(yī)學中對胃癌癥候有著系統(tǒng)的闡述，根據(jù)胃癌在臨床上的表現(xiàn)，可將中醫(yī)理論中的“胃脘痛”、“噎膈”、“反胃”、“伏梁”、“心腹痞”、“積聚”、“食痹”和“癥瘕”歸屬為胃癌的范疇[27,28]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法預測赤芍活性成分及抗胃癌作用靶點，共篩選出31個活性成分及102個成分和疾病交集靶點、15個關(guān)鍵活性成分以及17個核心靶點，通過分子對接技術(shù)對赤芍關(guān)鍵活性成分和篩選得到度值排名前5的靶點進行結(jié)合力打分，對接結(jié)果均顯示出一定結(jié)合活性，以此來探究中藥赤芍有效成分抗胃癌的作用機制，為下一步赤芍抗胃癌藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

通過赤芍成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，baicalein、beta-sitosterol、Stigmasterol、salicylic acid、paeonol、ellagic acid、Spinasterol、(+)-catechin、paeoniflorin、(2R,3R)-4-methoxyl-distylin、Sitogluside、paeoniflorgenone、3,4,5-trihydroxybenzoic acid、Methylgallate及Progallin A成分在中藥赤芍抗胃癌疾病中可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其中度值最高的化合物為baicalein，與之所對應(yīng)的靶點有45個，有研究表明，baicalein可通過調(diào)控p12-LOX、VEGF等相關(guān)蛋白的表達來抑制胃癌細胞的增殖和遷移[29]，通過下調(diào)TGF-/smad4信號通路和P38信號通路抑制胃癌細胞的遷移和侵襲能力[30,31]，還可誘導胃癌細胞凋亡，下調(diào)B淋巴細胞瘤的表達[32]以及抑制胃癌細胞糖代謝來抑制和干預胃癌的發(fā)展[33]，但其分子對接模擬過程中結(jié)合活性較低，可能與實際情況存在差異。(+)-catechi n為黃酮類化合物，杜培培[34]發(fā)現(xiàn)，(+)-catechin可以通過抑制ASICs的表達來抑制胃癌細胞的侵襲和遷移。研究發(fā)現(xiàn)，paeonol對胃癌細胞有明顯的增殖抑制作用[35]，還能通過調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2相關(guān)蛋白誘導胃癌細胞的凋亡，抑制胃癌細胞的侵襲和遷移能力，其機制可能與下調(diào)MMP-2/MMP-9有關(guān)[36]。beta-sitosterol、Stigmasterol、Spinasterol和Sitogluside為甾醇類成分，分子對接模擬實驗中與蛋白結(jié)合前3個化合物表現(xiàn)出了良好的結(jié)合活性，甾醇可抑制NF-B p65和Bcl-2蛋白的表達、促進Bax蛋白的表達以及Caspase-3的活化來抑制胃癌細胞的增長并誘導其凋亡[37]，其中beta-sitosterol可通過介導AMPK、PTEN和Hsp90抑制胃癌細胞生長[38]，PI3K/AKT/m TOR通路誘導細胞自噬[39]。Stigmasterol能誘導G2/M細胞周期停滯，抑制癌細胞遷移，還能抑制JAK/STAT信號通路[40]、Akt/mTOR通路[41]誘導腫瘤細胞凋亡和保護性自噬。根據(jù)蛋白 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)可得，ALB、AKT1、TP53、IL6、VEGFA、JUN、MAPK1、EGFR、TNF、MMP9、MAPK8、CASP3、PTGS2、FOS、ESR1、MAPK14及PETN可能是赤芍治療胃癌疾病的核心靶點。ALB是人體血清總蛋白中的主要蛋白質(zhì)成分，參與炎癥反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的各個階段[42]。AKT1可參與包括細胞凋亡和葡萄糖代謝在內(nèi)的細胞過程，有研究表明，AKT1在胃癌組織中高表達，AKT1參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移等生物學行為[43]，通過抑制AKT1的表達，可抑制胃癌細胞遷移及侵襲[44]。TP53可以誘導細胞衰老、凋亡、周期阻滯、DNA修復或代謝改變[45]。IL-6作為抗炎性肌細胞因子和促炎細胞因子在炎癥和B細胞成熟、促進T細胞的增殖以及促進或抑制腫瘤細胞的增長中起重要作用[46,47]。VEGFA作用于內(nèi)皮細胞可誘導血管生成，介導增加的血管通透性以及促進細胞遷移和抑制細胞凋亡，研究發(fā)現(xiàn)通過靶向調(diào)控VEGFA可抑制胃癌血管新生[48]，抑制VEGFA的表達來抑制胃癌細胞增殖、侵襲和遷移[49]，推測這些核心靶點與靶點相互作用，共同發(fā)揮著抗胃癌的作用。

通過GO富集和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，赤芍治療胃癌的抗癌途徑主要通過參與凋亡過程的負調(diào)控、藥物反應(yīng)等生物過程以及調(diào)控癌癥TNF、HIF-1等信號通路來完成的。在體內(nèi)腫瘤壞死因子（TNF）可介導多個細胞反應(yīng)[50]，TNF的失調(diào)可引起包括癌癥疾病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生[51-54]。有研究報道，TNF中TNF-亞基對胃癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲均有影響，可促進胃癌的發(fā)生[55]。TNF與胞外的TNF-R1結(jié)合形成的復合體還可激活RIP和TRAF2，并分別激活NIK和MKK，從而激活NF-B信號通路以及JNK信號通路來影響靶基因的轉(zhuǎn)錄。而HIF-1信號通路中HIF-1是由HIF-1與HIF-1兩個亞基組成的[56]。HIF-1的蛋白穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性的程度則主要受細胞內(nèi)氧濃度高低的影響[57]，對于腫瘤細胞來說，它是調(diào)節(jié)腫瘤細胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活因子[58]。有研究表明，HIF-1可能通過抑制APC表達，使-catenin累積，促進EMT的發(fā)生，從而促進胃癌的轉(zhuǎn)移，因此抑制HIF-1的活性可能是防止胃癌浸潤、轉(zhuǎn)移的治療新手段[58]。除此之外，P值排名不在前20的PI3K-AKT[59,60]通路、MAPK通路[61]和P53等信號通路在抗胃癌方面也發(fā)揮著重要作用。由此推測赤芍可能是通過誘導胃癌細胞凋亡、提高機體免疫力以及防止胃癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移來達到治療目的的。

通過分子對接技術(shù)驗證可知，赤芍中ellagic acid、paeoniflorgenone、beta-sitosterol和Stigmasterol等成分可以與ALB、AKT1、IL-6、TP53和VEGFA蛋白以氫鍵和疏水作用鍵形式較好地結(jié)合，且根據(jù)結(jié)合能打分，分數(shù)的絕對值越大，說明成分與蛋白結(jié)合的越好。由此推測中藥赤芍的有效成分是通過靶向蛋白來發(fā)揮抗胃癌作用的。

綜上所述，本研究通過將網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)二者相結(jié)合的方法來探討中藥赤芍抗胃癌疾病的活性成分、靶點及其作用機制，說明赤芍是通過多靶點、多成分和多途徑相互作用來治療胃癌疾病的，為中藥抗胃癌疾病的作用機制提供了理論上的參考和依據(jù)，后續(xù)還須對預測結(jié)果通過實驗進一步的驗證。