莫盛龍，夏宗元，李繼，李園園，劉紅昌，黃明進

（1.貴州大學農學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學石斛研究院，貴州 貴陽 550025；3.福泉市華源生態(tài)農業(yè)發(fā)展有限公司，貴州 福泉 550506；4.貴州省藥用植物繁育與種植重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

蜜環(huán)菌（Armillaria mellea）隸屬于擔子菌亞門（Basiaiomycotina）傘菌目（Agaricales）泡頭菌科（Physalacriaceae）蜜環(huán)菌屬[Armillaria（Fr.）Staude]，是一類經濟價值高并且為天麻生長所必須的共生真菌，為本身無法進行光合作用的天麻的生長繁殖提供營養(yǎng)物質，對天麻品質及產量的影響較大[1-4]，同時它又是重要的藥食兼用真菌，其產品制劑是治療眩暈、頭痛、神經衰弱的有效藥物，目前已廣泛應用于臨床治療[5]。蜜環(huán)菌在世界各大洲均有分布，廣泛分布于北美洲、歐洲和亞洲等許多國家的熱帶及溫帶森林地區(qū)，前人通過互交不育性實驗鑒定蜜環(huán)菌生物種多達40種，蜜環(huán)菌種類繁多，在我國主要有5個族17個種，其中高盧蜜環(huán)菌族有9個種，分別是Armillaria ingular、Armillaria gallica、Armillaria calvescens、Armillaria cepistipes、Armillaria sinapina、NABSX、Armillaria nabsnona、Armillaria luteopileata、Armillaria jozaensis；奧氏蜜環(huán)菌族有Armillaria ostayae、Armillaria gemina、Armillaria borealis 3個種；蜜環(huán)菌族有Armillaria mellea、CBSG 2個種；假蜜環(huán)菌族有Armillaria tabescens、Armillaria monadelpha 2個種；棘皮蜜環(huán)菌族只有Armillaria ectypa 1個種，主要分布在黑龍江、吉林、河南、山西、青海、云南、內蒙古、西藏及臺灣等地區(qū)[6]。長期以來，由于鑒定手段的局限，用于鑒定真菌種的都是形態(tài)學特征，隨著研究的不斷深入，蜜環(huán)菌的鑒定方法從傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定發(fā)展到如今的分子生物學鑒定。當前用于蜜環(huán)菌分子鑒定的技術手段主要包括擴增核糖體基因（Ribosomal DNA,rDNA）、限制性內切酶的酶切、限制性片段多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）和隨機擴增微衛(wèi)星（random amplified microsatellite,RAMS）等[7]。其中核糖體基因被認為是最能反映物種間遺傳關系的指標之一[8]，真核生物核糖體基因是高度重復的串聯(lián)序列單位，18S、5.8S和26S rDNA聯(lián)結在一起，作為一個轉錄單位。18S～26S和rDNA之間的內轉錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer,ITS）被5.8S分為ITS1和ITS2兩部分，由于該區(qū)具有選擇壓力較小、DNA堿基替換速率較快、拷貝數(shù)較大、適中的長度以及快速的同步進化等特點被廣泛應用于真菌類群的系統(tǒng)演化和發(fā)育研究[9-11]。不同蜜環(huán)菌菌株在ITS區(qū)存在豐富的變異，變異以點突變?yōu)橹?，且變異位點相互獨立，通過擴增rDNA-ITS保守序列，可以對廣泛的種類進行鑒定[12]。本文采用真菌通用引物ITS4/ITS5對11份蜜環(huán)菌種質的rDNAITS區(qū)段序列進行擴增和測序，利用MEGA-X軟件對11份蜜環(huán)菌進行分類，并基于ITS序列進行核酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank同源性檢索比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構建，使用DNAMAN軟件對其特征序列進行比對分析，以期為蜜環(huán)菌種質資源的分類、鑒別及種質資源評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株于2020年6月收集，其中M-01～M-07均來自貴州大學農學院、M-08購買于都勻市勻洞鎮(zhèn)馬場村峻康生態(tài)農業(yè)發(fā)展有限公司、M-09購買于黔東南興昌菌業(yè)科技有限公司、M-10購買于宜昌市裕禾菌業(yè)有限公司、M-11在福泉市仙橋鄉(xiāng)月塘村野生蜜環(huán)菌子實體分離純化，共11份蜜環(huán)菌種質。

1.2 主要試劑及設備

真菌基因組DNA提取試劑盒（Solarbio，D2300）；金牌Mix（Cat.TSE101，Lot.0BH21301）；瓊脂糖（Bio topped,Cat No.A6190,Lot No:190715）；DNA Ladder（BIOMIGA，Cat.#:9156，Lot.#:Specified on product label）；Marker（BIOMIGA，Cat.No:M2000，Lot.No:20200907）；1 TBE速溶顆粒（擎科生物，Cat.TSG002，Lot.1GO20701）；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（上海博微生物科技有限公司，190710）；立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠，LDZF-50L）；超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，DL-CJ-1NDⅡ）；電泳儀（BIORAD，Model No.PowerpacTMBasic）；離心機（Thermo Fisher Scientific，Sorvall Legend 17R）；PCR儀（成都錦世昌祥科技有限公司，C1000 TouchTMThermal Cycler）；凝膠成像儀（BIORAD，Model No:Universal HoodⅡ，Serial No:721BR03885）等。

1.3 培養(yǎng)基配制

分離純化培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar,PDA），按照說明書使用；活化培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基中加入馬鈴薯200.0 g、葡萄糖10.0 g、蔗糖10.0 g、蛋白胨2.0 g、磷酸二氫鉀1.0 g、硫酸鎂0.5 g及瓊脂粉12.0 g，pH=6.0，馬鈴薯去皮，切成丁，加入適量的清水煮沸，持續(xù)沸騰期間用鐵勺搗碎，單層紗布過濾，分3次進行，濾液加水至1 L后，加入其他原料，攪拌煮沸。

1.4 蜜環(huán)菌分離純化與活化

蜜環(huán)菌的分離：將野外采集到的蜜環(huán)菌子實體在超凈工作臺中用75%的酒精棉球擦試菌蓋表面，迅速用無菌水沖洗菌蓋，再用無菌棉球擦干菌蓋上的水，用鑷子撕去菌蓋表皮，在菌柄與菌蓋交接處切取0.3～0.5 cm2的組織塊，接種于PDA培養(yǎng)基上，置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)30 d，與搜集的蜜環(huán)菌原種存放于4～8℃環(huán)境中保存?zhèn)溆?。蜜環(huán)菌的活化：將分離純化和收集的原種菌絲或菌塊接種于活化培養(yǎng)基中，置于25℃的培養(yǎng)室內避光培養(yǎng)，根據(jù)褐化情況置于4～8℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 樣品基因組DNA提取及測定

取活化后的新生蜜環(huán)菌菌絲，用液氮速凍，磨成粉狀，按照真菌基因組DNA提取試劑盒操作。取2.5L提取的基因組DNA用0.9%瓊脂糖凝膠進行電泳分析以便了解提取情況。

1.6 序列擴增

1.6.1 引物序列 本實驗引物為核糖體基因序列的通用引物ITS4/ITS5[13]：ITS4堿基序列為5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'，ITS5堿基序列為5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3'，由北京擎科生物科技有限公司重慶分公司合成。

1.6.4 擴增序列分析 通過DNAMAN6.0軟件進行序列比對分析，根據(jù)初步分類結果，登錄NCBI網（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）提交序列，BLAST搜索分析，條件為高相似度序列，下載與11份蜜環(huán)菌種質相似大的15份蜜環(huán)菌基因序列和1份茶樹耐鋁內生真菌序列作為外群（表1），利用MEGA-X軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

表1 用于系統(tǒng)發(fā)育分析的類群的GenBank登錄號Table 1 GenBank accession numbers of the taxa used for phylogenetic analysis

2 結果

2.1 PCR擴增產物檢測

采用1%瓊脂糖凝膠電泳在凝膠成像系統(tǒng)中拍照，對PCR擴增產物進行檢測，結果表明，11份蜜環(huán)菌種質在ITS序列上的擴增成功率均為100%，每份蜜環(huán)菌種質在750～1 000 bp處只有1個條帶且條帶清晰（圖1）。

圖1 11份蜜環(huán)菌種質rDNA-ITS序列PCR擴增產物檢測Fig.1 Detection of PCR amplification products of the 11strains with rDNA-ITS sequences

2.2 11份蜜環(huán)菌種質聚類

11份蜜環(huán)菌種質樣品測序峰圖較好，序列拼接后，長度為851～895 bp，利用DNAMAN軟件對所有序列進行多重對位排列，手動將對位排列結果中5'和3'端的非對位排列區(qū)去除，序列長度為848～866 bp，通過構建同源樹對11份蜜環(huán)菌種質進行聚類，結果表明，11份蜜環(huán)菌種質劃分為兩個大類和4個亞類，第Ⅰ類包括M-01～M-05和M-08～M-10，相似度為99%，第Ⅰ-Ⅰ類包括M-01、M-02、M-04、M-05和M-08～M-10，相似度為100%，第Ⅰ-Ⅱ類為M-03；第Ⅱ類包括M-06、M-07和M-11，相似度為99%，第Ⅱ-Ⅰ類包括M-06和M-07，相似度為100%，第Ⅱ-Ⅱ類為M-11（圖2）。

圖2 基于rDNA-ITS序列的11份蜜環(huán)菌種聚類分析Fig.2 Clustering analysis ofstrains base d on rDNA-ITS sequence

2.3 特征序列分析

分別對這兩個大類的蜜環(huán)菌種質進行多序列比對分析，同上（2.2）去除非對位排列區(qū)后，第Ⅰ類序列長度均為847 bp，第Ⅱ類序列長度均為873 bp，參考模式菌株蜜環(huán)菌（登錄號：KT822289）對各區(qū)段進行大致劃分，即18S區(qū)為1～34 bp，ITS1區(qū)為35～273 bp，5.8S區(qū)為274～431 bp，ITS2區(qū)為432～815 bp，28S為816～864 bp，其中第Ⅰ類蜜環(huán)菌種質M-03在ITS1區(qū)段發(fā)生5個堿基置換，分別在120 bp、121 bp、148 bp、164 bp和266 bp處由C→T，在ITS2區(qū)段發(fā)生3個堿基置換，分別在597 bp和693 bp處由A→G，在664 bp處由G→A，共有序列長度為840 bp，其中堿基A、C、G和T所占比例分別為33.0%、23.1%、21.1%和22.9%，C+G含量為44.2%（表2）；第Ⅱ類蜜環(huán)菌種質M-11在ITS1區(qū)段發(fā)生4個堿基置換，分別在100 bp處由T→C，在125 bp和147 bp處由G→A，在373 bp處由A→G，在ITS2區(qū)段僅有1個堿基發(fā)生置換，在706 bp處由C→T，共有序列長度為869 bp，其中堿基A、C、G和T所占比例分別為33.7%、23.6%、19.0%和23.7%，C+G含量為42.6%（表3）。上述表明，11份蜜環(huán)菌種質在18S、5.8S和28S區(qū)較保守，變異的信息位點主要在ITS1和ITS2。

表2 第Ⅰ類蜜環(huán)菌種質特征位點Table 2 Characteristic loci of the classⅠstrains

表2 第Ⅰ類蜜環(huán)菌種質特征位點Table 2 Characteristic loci of the classⅠstrains

編號 Serial number特征位點 Characteristic loci ITS1 ITS2 120 121 148 164 266 597 693 664 M-01 C C C C C A A G M-02 C C C C C A A G M-03 T T T T T G G A M-04 C C C C C A A G M-05 C C C C C A A G M-08 C C C C C A A G M-09 C C C C C A A G M-10 C C C C C A A G

表3 第Ⅱ類蜜環(huán)菌種質特征位點Table 3 Characteristic loci of the classⅡ

表3 第Ⅱ類蜜環(huán)菌種質特征位點Table 3 Characteristic loci of the classⅡ

編號 Serial number特征位點 Characteristic loci ITS1 ITS2 100 125 147 373 706 M-06 T G G A C M-07 T G G G C M-11 C A A G T

對兩個大類的共有序列進行兩對序列對比分析，同上（2.2）去除非對位排列區(qū)后，兩對共有序列相似度為88.71%，堿基變異位點豐富，且除堿基的置換外，還存在堿基的缺失，在18S區(qū)有1個位點堿基發(fā)生置換，在ITS1區(qū)有23個位點堿基缺失，22個位點堿基發(fā)生置換，在5.8S區(qū)有8個位點堿基發(fā)生置換，在ITS2區(qū)有21個位點堿基發(fā)生置換，12個位點堿基缺失，在28S區(qū)有4個位點堿基發(fā)生置換，1個位點堿基缺失（表4）。表明采用通用引物ITS4/ITS5擴增的序列可以對這兩類蜜環(huán)菌種質進行區(qū)分。

表4 第Ⅰ類和第Ⅱ類蜜環(huán)菌種質共有序列特征位點Table 4 Characteristic loci of the classⅠandⅡcommon sequencesstrains

表4 第Ⅰ類和第Ⅱ類蜜環(huán)菌種質共有序列特征位點Table 4 Characteristic loci of the classⅠandⅡcommon sequencesstrains

編號 Serial number特征位點 Characteristic loci 18S ITS1 12 64 98 100 102 104 105 108ⅠG G G A T--AⅡA C A C G A C T編號 Serial number ITS1 109 120 121 122 123 124 125 126ⅠA G------ⅡT C C G C G C T編號 Serial number ITS1 127 128 133 144 148 162 164 165Ⅰ--G G G C C AⅡA A T C C A --編號 Serial number ITS1 196 199 235 238 240 241 242 243ⅠA T T G----Ⅱ-C G A A G T T編號 Serial number ITS1 244 255 246 249 254 257 258 262Ⅰ---C G T G CⅡC C T T C A A T編號 Serial number ITS1 263 271 275 282 365 374 379 380Ⅰ-G--A A C AⅡT A C C G C A T編號 Serial number 5.8S 381 391 392 399 400 405 409 414ⅠT G C C C G G GⅡA A T T G A C C

續(xù)表

2.4 種內種間遺傳距離計算

利用MEGA-X軟件，對11份蜜環(huán)菌種質進行多序列比對，同上（2.2）去除非對位排列區(qū)后，對其種內種間遺傳距離進行計算，遺傳距離的大小既反映了物種間的相似度大小，也反映了它們之間的遺傳多樣性，遺傳距離越小，表明它們之間相似度越大，遺傳多樣性就越小。反之，遺傳距離越大，它們之間相似度越小，遺傳性多樣就越大。結果表明：11份蜜環(huán)菌種質種內遺傳距離均為0.000，第Ⅱ-Ⅰ類與第Ⅱ-Ⅱ類蜜環(huán)菌種質的種間遺傳距離最大為0.035，第Ⅰ-Ⅰ類與第Ⅱ-Ⅱ類、第Ⅰ-Ⅱ類與第Ⅱ-Ⅰ類及第Ⅰ-Ⅰ類與第Ⅱ-Ⅰ類蜜環(huán)菌種質的種間遺傳距離次之，分別為0.033、0.032和0.031，第Ⅰ-Ⅰ類與第Ⅰ-Ⅱ類和第Ⅰ-Ⅱ類與第Ⅱ-Ⅱ類蜜環(huán)菌種質的種間遺傳距離最小，分別為0.004和0.002（表5）。因此，第Ⅱ-Ⅰ類與第Ⅱ-Ⅱ類蜜環(huán)菌種質的相似性小，具有較豐富的遺傳多樣性，而第Ⅰ-Ⅰ類與第Ⅰ-Ⅱ類和第Ⅰ-Ⅱ類與第Ⅱ-Ⅱ類蜜環(huán)菌種質，相似性大，遺傳多樣性程度較低。

表5 11份蜜環(huán)菌種質種內種間遺傳距離計算Table 5 Genetic distance between species and within species of 11strains

表5 11份蜜環(huán)菌種質種內種間遺傳距離計算Table 5 Genetic distance between species and within species of 11strains

編號Serial number M-01 M-02 M-03 M-04 M-05 M-06 M-07 M-08 M-09 M-10 M-01 M-02 0.000 M-03 0.004 0.004 M-04 0.000 0.000 0.004 M-05 0.000 0.000 0.004 0.000 M-06 0.031 0.031 0.032 0.031 0.031 M-07 0.031 0.031 0.032 0.031 0.031 0.000 M-08 0.000 0.000 0.004 0.000 0.000 0.031 0.031 M-09 0.000 0.000 0.004 0.000 0.000 0.031 0.031 0.000 M-10 0.000 0.000 0.004 0.000 0.000 0.031 0.031 0.000 0.000 M-11 0.033 0.033 0.035 0.033 0.033 0.002 0.002 0.033 0.033 0.033

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST對比，搜索并下載與11份蜜環(huán)菌種質相似較高的15份同源的蜜環(huán)菌序列及1份茶樹耐鋁內生真菌序列（表1），利用MEGA-X軟件進行多序列比對，采用鄰接法（NJ）構建ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結果顯示11份蜜環(huán)菌種質與下載的同源蜜環(huán)菌序列均沒有歸在一類。因此，11份蜜環(huán)菌可能是一個較為龐大的復合群，采用通用引物ITS4/ITS5擴增的核糖體基因可以對此類蜜環(huán)菌進行分類但不適合作為鑒定的持家基因。

圖3 基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖Fig.3 Phylogenetic tree based on the rDNA-ITS sequence

3 討論

本實驗采用通用引物ITS4/ITS5擴增11份蜜環(huán)菌種質的核糖體基因，通過構建同源樹聚類、特征序列對比、種內種間遺傳距離計算及在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載15個相似度較大的蜜環(huán)菌序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，得出結論：11份密環(huán)菌種質可能是一個較為龐大的復合群，采用通用引物ITS4/ITS5擴增的核糖體基因可以對此類蜜環(huán)菌進行分類但不適合作為鑒定的持家基因。

楊海旭[14]對秦巴山區(qū)分離的18株蜜環(huán)菌利用通用引物ITS1/ITS4對ITS序列擴增，對序列進行兩兩相似比較，通過構建系統(tǒng)進化樹對18株蜜環(huán)菌進行了鑒定及親緣關系分類；彭述敏[15]采用通用引物ITS4/ITS5對供試3個蜜環(huán)菌菌株進行鑒定，初步確定各蜜環(huán)菌菌株的分類地位為：SNA01為芥黃蜜環(huán)菌Armillaria sinapina Berub＆Dessur，SNA04為高盧蜜環(huán)菌Armillaria gallica Marxm＆Romagn，京-234為蜜環(huán)菌Armillaria mellea（Vahl:Fr.）P.Kumm；陸春云[16]利用通用引物組合ITS4/ITS5和通用引物組合983F/2218R對7株蜜環(huán)菌進行鑒定，將菌株1～5號歸為了一族，菌株6～7號分為另一族，且菌株6號形成了一個分離良好（70%）的姐妹系Armillaria mellea（AFTOL-ID449），7號菌株與其他近緣種分離良好（72%），表明菌株6號和菌株7號可能與其他蜜環(huán)菌為不同的種，甚至可能為不同的族。以上這些研究方法和研究結果對蜜環(huán)菌屬的分子鑒定和分類提供了重要的參考資料。蜜環(huán)菌屬種質資源豐富，外觀鑒定較困難，為保證蜜環(huán)菌的優(yōu)質穩(wěn)定，種質溯源是關鍵，但在本次研究中，采用通用引物ITS4/ITS5擴增核糖體基因，僅將11份蜜環(huán)菌種質分為了兩個大類4個亞類，不能進一步鑒定到種，因此，需繼續(xù)找更加合適、穩(wěn)定的持家基因或結合其他引物擴增的序列，利用NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST對比進一步對11份蜜環(huán)菌種質進行鑒定。